Development of new antibody-drug conjugates based on Fc binding moieties for therapeutic and diagnostic applications

Monoclonal antibodies (mAbs) are extensively used in several therapeutic fields and in particular are used against cancer as therapeutic entity and/or targeting agents. The last application belongs to the several strategies to promote selective drug delivery in order to spare healthy tissues from unspecific toxicities of invasive therapies, as anticancer treatments, and to improve final clinical outcomes. Among all, targeted therapy includes antibody-drug conjugates (ADCs) approach, which exploit the synergic action of potent cytotoxic agents conjugated to a monoclonal antibody (mAb) coupled by specific linkers. The antibody acts as drug-carrier and targeting agent, and eventually also as a drug per se, in order to selectively kill cancer cells. As single therapeutic agents, both mAbs and highly cytotoxic drugs present critical issues in their clinical use. mAbs usually have to be used in combination therapy with other drugs because the majority of them show an insufficient, although specific, clinical response. On the other hand, chemotherapeutic drugs, especially the very potent ones, have a narrow therapeutic window and, therefore, their therapeutic doses are close to the maximum tolerated dose. Consequently, they present heavy side effects owing to the lack of tumour cells selectivity. The bright idea to combine mAbs and cytotoxic drugs in a unique entity offers the possibility to overcome their limitations. Traditionally, drugs have been coupled in a random way to lysine or cysteine residues, and the final product heterogeneity unfortunately has relevant impact on ADC activity, characterization and manufacturing, thus affecting the efficacy of the therapy. In an era in which product homogeneity and batch-to-batch reproducibility are essential pre-requisites for pharmaceutics, the development of new technologies for site-directed coupling have become a primary focus. New methodologies for site-specific conjugation are now widely investigated, and some example are the introduction of cysteine residues using site-directed mutagenesis, the use of enzymes, the insertion of un-natural amino acids and the conjugation to Fc N-Glycans. Nevertheless, such approaches require a specific development of each new ADC, thus offering few opportunities of know-how sharing between different projects, in fact these are often limited to the linker stability and the drug activity. In this work, a new construct for the delivery of active drugs has been proposed based on mAbs non-covalently interacting with a Fc-binding moiety (FcBM) that carries also the drugs. The aim is to achieve a higher degree of homogeneity and create a versatile and adaptable drug delivery system. Drug is not linked directly to the FcBM but through a linker constituted of a linear PEG chain. The drug-PEG-FcBM/antibody systems, from here called Antibody-Drug Systems (ADSs), present some advantages with respect to ADCs: they can be a versatile platform with which different mAbs can be used by simple mixing on demand with a drug-Fc binding module on the basis of the target tumour/disease to be treated. FcBM is the core of the system and must present unique binding properties for the Fc of antibodies. In this work, Protein G (22.8 kDa), a bacterial Fc binding receptor, and a goat Fab’ (≈ 50 kDa) against human Fc were tested as FcBM candidate, while a PEG chain was selected as linker for drug/dye attachment. Protein G was selectively PEGylated at the N-terminus with a PEG 20kDa, while Fab’ was mono-, bi- and tri-PEGylated with a PEG 5 kDa after the reduction of the sulfhydryl bridges at the hinge region of the progenitor F(ab’)2. Circular dichroism studies showed that the conjugates preserved protein secondary structure and isothermal titration calorimetry experiments determined that their affinity for Fc is about 107-108 M-1. After the complexation with a model mAb (Trastuzumab or Rituximab), NIR labelled ADSs were tested in vitro by cytometry analysis showing a high selectivity for antigen expressing cells. Furthermore, when a FcBM is conjugated to labelling molecule instead of a drug it would allow the switch from therapeutic application to diagnosis purposes. Tubulysin A (TubA), a potent inhibitor of tubulin polymerisation, was selected as drug model and tethered to the free end of PEG through a disulphide bond. TubA-PEG-Protein G/Trastuzumab ADS showed a preferential cytotoxic activity against the HER2+ cell line (SKBR-3), thus supporting the approach for both diagnostic and therapeutic purposes in cancer. A preliminary biodistribution study was performed in immunodeficient NSG mice, inoculated via subcutaneous injection with IGROV-1 (HER2-) and SKOV-3 (HER2+) tumour cells. Total body scanning showed a very rapid accumulation of Cy5-PEG-Protein G/Trastuzumab within 8 hours from ADS injection. Finally, uptake and intracellular trafficking of an ADS composed by a mouse IgG2a against ICAM-1 and Protein G as FcBM were evaluated in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). HUVECs were stimulated with TNFα to promote the expression of ICAM-1 receptor toward which the ADS was targeted. Fluorescence microscopy was used to follow ADS internalization by endothelial cells. The results disclosed that mechanism of uptake was based on CAM-mediate endocytosis, which relies in the binding between the receptor and anti ICAM-1 antibody. After internalization, the ADS followed the classical pathway toward the lysosomes to be degraded. This proves the possibility to achieve a selective intracellular delivery of active agents through ADS approach and open the way of new applications of this technology.

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono largamente utilizzati in diversi campi terapeutici e in particolare nel contro il cancro, come entità terapeutica e/o agenti direzionanti. Quest'ultima applicazione rientra nell’insieme delle diverse strategie per promuovere il trasporto selettivo dei farmaci al sito d’azione, al fine di risparmiare i tessuti sani dalla tossicità aspecifiche propria di molte terapie invasive, quali la chemioterapia, e per migliorare i risultati clinici finali. Tra le terapie direzionate rientra l'uso degli anticorpi coniugati a farmaci, che sfruttano l'azione sinergica di potenti agenti citotossici coniugati ad un anticorpo monoclonale attraverso specifici linker. L'anticorpo agisce come agente di trasporto e agente direzionante, e anche come farmaco di per sé, al fine di colpire selettivamente le cellule cancerose. Come singoli agenti terapeutici, sia gli anticorpi monoclonali che i farmaci altamente citotossici presentano problemi critici nel loro impiego clinico. Gli anticorpi monoclonali di solito devono essere usati in terapia combinata con altri farmaci perché la maggior parte di essi mostra una risposta clinica insufficiente, sebbene specifica. D'altra parte, i farmaci chemioterapici, specialmente quelli molto potenti, hanno una ristretta finestra terapeutica e, pertanto, le dosi terapeutiche sono prossime alla dose massima tollerata. A causa della mancanza di selettività per le cellule tumorali, questi farmaci presentano pesanti effetti collaterali. La brillante idea di unire anticorpi monoclonali e farmaci citotossici in un'entità unica offre la possibilità di superare i limiti appena discussi. Tradizionalmente, i farmaci sono stati coniugati in modo aspecifico ai residui di lisina o cisteina; tuttavia, l'eterogeneità del prodotto finale ha un impatto rilevante sull'attività, sulla caratterizzazione e sulla produzione dei coniugati farmaco-anticorpo, influenzando così l'efficacia della terapia. In un'epoca in cui l'omogeneità del prodotto e la riproducibilità da lotto a lotto sono prerequisiti essenziali per lo sviluppo di una nuova forma farmaceutica, lo studio di nuove tecnologie per la coniugazione sito-specifica è diventato un obiettivo primario. Nuove metodologie per la coniugazione site-specifica sono ora ampiamente studiate e alcuni esempi sono: l'introduzione di residui di cisteina mediante mutagenesi sito-diretta, l'uso di enzimi, l'inserimento di aminoacidi non naturali e la coniugazione ai glicani della regione Fc. Tuttavia, tali approcci richiedono uno sviluppo mirato e a sé stante per ogni nuovo coniugato farmaco-anticorpo, offrendo quindi poche opportunità di adattamento delle metodologie tra diversi progetti, che hanno come elementi limitanti la stabilità del linker e l'attività del farmaco. In questo lavoro, è stato proposto un nuovo costrutto per la somministrazione di farmaci attivi basato su anticorpi monoclonali che interagiscono in modo non covalente con una molecola avente alta affinità per la regione Fc (detta FcBM) e che lega anche i farmaci. L'obiettivo è il raggiungimento di un grado più elevato di omogeneità e la creazione di un sistema di somministrazione di farmaci versatile e adattabile. Il farmaco non è legato direttamente all'FcBM ma è presente un linker costituito da una catena di PEG lineare. I sistemi anti-PEG-FcBM/anticorpo, da qui chiamati sistemi farmaco-anticorpo (ADS), presentano alcuni vantaggi rispetto i coniugati farmaco-anticorpo: costituiscono una piattaforma versatile con la quale si possono utilizzare diversi anticorpi semplicemente per aggiunta al modulo farmaco-FcBM in base al tumore bersaglio/malattia da trattare. L’FcBM è il cuore del sistema e deve presentare proprietà di legame uniche per la regione Fc degli anticorpi. In questo lavoro, la proteina G (22,8 kDa), un recettore batterico per l’Fc e un Fab' caprino (≈ 50 kDa) contro l’Fc umano sono stati testati come potenziali candidati per il ruolo di FcBM, mentre una catena PEG è stata selezionata come linker per l'attacco del farmaco/marcatore. La proteina G è stata selettivamente PEGhilata all'N-terminale con un PEG 20kDa, mentre il Fab' è stato mono-, bi- e tri-PEGhilato con un PEG 5 kDa dopo la riduzione dei ponti sulfidrilici nella regione di cerniera del F(ab')2 progenitore. Studi di dicroismo circolare hanno dimostrato che i coniugati hanno conservato la struttura secondaria della proteina, mentre gli esperimenti di calorimetria isotermica di titolazione hanno determinato che la loro affinità per l’Fc è circa 107-108 M-1. Dopo la complessazione con un anticorpo modello (Trastuzumab o Rituximab), gli ADS marcati con coloranti sono stati testati in vitro mediante analisi citometrica, che mostra un'elevata selettività per le cellule che esprimono l'antigene. Inoltre, il legame dell’FcBM a un marcatore anziché ad un farmaco consentirebbe il passaggio dal campo terapeutico al campo diagnostico. La Tubulisina A (TubA), un potente inibitore della polimerizzazione della tubulina, è stato selezionato come farmaco modello e coniugato all’estremità libera del PEG attraverso un legame disolfuro. Il sistema TubA-PEG-Protein G/Trastuzumab ha mostrato un'attività citotossica preferenziale contro la linea cellulare HER2 + (SKBR-3), dimostrando così la possibile applicazione sia per scopi diagnostici che terapeutici nel cancro. Uno studio preliminare di biodistribuzione è stato condotto su topi NSG immunodeficienti, inoculati mediante iniezione sottocutanea con cellule tumorali IGROV-1 (HER2-) e SKOV-3 (HER2 +). La scansione total body ha mostrato un accumulo molto rapido di Cy5-PEG-Protein G/Trastuzumab entro 8 ore dall'iniezione. Infine, l’internalizzazione e il traffico intracellulare di un ADS, composto da un anticorpo murino IgG2a contro l'ICAM-1 umano e la proteina G come FcBM, sono stati valutati in cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC). Le HUVEC sono state stimolate con il TNFα per promuovere l'espressione del recettore ICAM-1 verso il quale l'ADS è direzionato. La microscopia di fluorescenza è stata utilizzata per seguire l'internalizzazione dell’ADS nelle cellule endoteliali. I risultati hanno rivelato che il meccanismo di internalizzazione è l'endocitosi mediata da CAM, che si basa sul legame tra il recettore e l'anticorpo anti-ICAM-1. Dopo l'internalizzazione, l'ADS segue il classico percorso verso i lisosomi per essere degradato. Ciò dimostra la possibilità di ottenere un direzionamento intracellulare selettivo di agenti attivi attraverso l'approccio ADS e apre la strada a nuove applicazioni per questa tecnologia.