Structural and functional characterization of A-B toxins: diphtheria toxin and clostridial neurotoxins

I performed my doctorate research activity studying three important human pathogens that are A-B toxins: Diphtheria Toxin (DT), Tetanus Neurotoxin (TeNT) and Botulinum neurotoxins (BoNTs), the etiologic agents of diphtheria, tetanus and botulism respectively. In terms of structural organization these toxins consist of three domains, which are termed L chain (the N-terminal catalytic domain), HN (the transmembrane domain), and HC (the C-terminal binding domain). These domains are closely related to the common four step mechanism of action: membrane binding mediated by HC, endocytosis, membrane translocation mediated by HN and L-chain mediated substrate modification. I studied the conformational change of diphtheria toxin at acidic pH. DT includes a T domain which is known to mediate the pH-dependent membrane translocation, by forming a channel through which the catalytic domain crosses the endocytic vesicle membrane. To date no structural data are available about the pore/channel formed by the T domain, nor is known if it is monomeric or oligomeric. I have performed biochemical and structural studies to characterize the T domain of DT. The T domain is also considered a prospective anti-cancer agent for the targeted delivery of cytotoxic therapy to cancer cells. I obtained the crystal structure of DT in the presence of lipid bicelles (which simulate the endocytic vesicle membrane) and grown at pH 5.5, pH that mimics the acidic environment where translocation takes place. The reported structure throws lights on the initial event of this process, the destabilization of the three α-helices present at the bottom of the toxin (Leka et al., 2014). I then worked on a project which aimed to unravel the three dimensional structure of tetanus neurotoxin by crystallization studies. Because TeNT is considered “uncrystallizable” I focused on the use of antibody fragments (Fabs) as crystallization chaperons to aid the structural determination. Native gel analysis and size exclusion chromatography showed the formation of a stable complex in vitro between TeNT and the relative Fabs. Several crystallization experiments were carried out by high throughput crystallization screens. Further, I performed functional analysis on the trafficking of botulinum neurotoxin at the neuromuscular junction (NMJ). I expressed the binding domains of different BoNT serotypes, which are both necessary and sufficient for binding to the neuronal surface and internalization. The two step purifications, chromatography and gel filtration, were sufficient to yield purifications of each binding domain to >90% purity. Using cerebellum granular neurons (CGNs), I tested their functionality and specificity. I performed also in vivo assays in order to analyze their distribution along the NMJ. The data from fluorescence analysis show high specificity of these binding domains at the NMJ, and a different staining between different BoNT serotypes, reflecting their different time of intoxication, and perhaps a different pathway of vesicular trafficking.

Ho effettuato la mia attività di ricerca studiando tre importanti patogeni umani, che sono tossine di tipo A-B: la tossina difterica (DT), la neurotossina tetanica (TeNT) e le neurotossine botuliniche (BoNTs), gli agenti eziologici di difterite, tetano e botulismo, rispettivamente. In termini di organizzazione strutturale queste tossine sono costituite da tre domini: il dominio catalitico (LH), il dominio di translocazione (HN) e il dominio di legame (HC). Questa organizzazione dei domini è strettamente correlata al loro comune meccanismo d’azione che comprende: il legame alla membrane cellulare mediato dal HC, la traslocazione del dominio catalitico nel citoplasma mediata dal canale di permeazione formato dal HN. Ho studiato il cambiamento conformazionale della tossina difterica a pH acido. DT include un dominio di translocazione (dominio T), che forma il canale attraverso il quale il dominio catalitico attraversa la membrana della vescicola endosomica. Fino ad oggi non ci sono dati strutturali che riguardano il canale formato dal dominio T, non si sa neanche se è un monomero o oligomero. Ho eseguito studi biochimici e strutturali per caratterizzare il dominio T di DT. Il dominio T è anche considerato un agente anti-cancro nelle terapie mirate contro le cellule tumorali. Ho ottenuto la struttura tridimensionale della tossina difterica in presenza di doppi strati lipidici (che simulano la membrana della vescicola endosomica) ed in condizioni di pH 5,5 (pH corrispondente all'ambiente acido in cui avviene la il processo di traslocazione). La struttura riportata getta luci sull'evento iniziale di questo processo, la destabilizzazione di tre alfa-eliche presenti nella parte inferiore della tossina (Leka et al., 2014). Ho poi lavorato su un progetto che mirava a caratterizzare la struttura tridimensionale della tosssina tetanica. Poiché la cristallizzazione di questa tossina risulta d’essere molto difficile, mi sono concentrata sull'utilizzo di frammenti di anticorpi (Fab) come tools per aiutare la determinazione strutturale. Analisi da gel nativo e da cromatografia ad esclusione mostrano la formazione di un complesso stabile in vitro tra la tossina ed i relativi Fab. Diversi esperimenti di cristallizzazione sono stati eseguiti, e per il momento non abbiamo ancora informazioni strutturali sulla tossina. Inoltre, ho studiato anche la localizzazione ed il processo di internalizzazione delle tossine botuliniche a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ). Ho espresso i domini di legame di diversi sierotipi di tossine botuliniche, domini che sono necessari e sufficienti per il legame alla superficie dei neuroni. I domini di legame sono stati purificati utilizzando cromatografia di affinità e per esclusione, ottendo alla fine una purezza > 90% . Utilizzando i neuroni granulari di cervelletto (CGN), ho testato la loro funzionalità e specificità. Questi domini sono stati iniettati in vivo al fine di analizzare la loro localizzazione a livello della giunzione neuromuscolare. I dati ottenuti con analisi di microscopia confocale ed a fluorescenza mostrano che questi domini si localizzano proprio a livello della giunzione muscolare. Nelle marcature si osserva anche una colorazione diversa tra i diversi sierotipi BoNT, e questo risultato riflette il diverso tempo di intossicazione tra i vari serotipi di tossine botuliniche, e forse anche una diversa localizzazione in diverse vescicole endosomiche.