Leucemie linfoblastiche acute T pediatriche: Analisi di mutazione attraverso il sequenziamento di ampliconi o dell'intero esoma

Background. Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most frequent neoplastic disease in children and it is generally characterized by favorable outcome, with the long-term cure rate approaching 90%. The stratification of patients into risk groups allows a more specific risk-adapted treatment, saving patients with a low risk of relapse from excessive toxicity, while improving outcome in patients with a high risk of relapse by intensive treatment. Risk stratification has been based on clinical features and response to treatment. NOTCH1 activation and PTEN inactivation are common events implied in leukemogenesis, and appear attractive candidates as drivers for risk stratification. NOTCH1 is involved in transcriptional upregulation of IL7R, a gene known to be mutated in 10% of T-ALL cases. In addition, the NOTCH1 signaling is also involved in the regulation of cyclin D3. This protein is involved in cell proliferation and it is necessary for T-ALL development. Given the fact, in recent studies new genetic alterations are associated with prognosis and could be used for patient's stratification, as well as for targeted therapy. All these highlight the import of the identification of new mutations that could play a pivotal role in the leukemogenesis. Aim of the study. The purpose of this study was to evaluate the prognostic significance NOTCH1 and PTEN alterations in childhood T-ALL. To this purpose, a large pediatric T-ALL patient cohort treated according to the AIEOP ALL2000/R2006 and AIEOP ALL2009 protocols was comprehensively characterized with respect to NOTCH1 and PTEN; the NOTCH1/PTEN mutational status were then correlated with the cumulative incidence of relapse and event free survival. Using the somatic mutations as specific genetic markers for tumor cell we applied next-generation ultra-deep sequencing technologies to detect the presence of residual cells in the bone marrow samples during therapy is the second aim of this study. Therefore, the mutational status of IL7R at diagnosis and +33 day therapy was characterized and it was then correlated with MRD RQ-PCR. Finally, it was analyzed the CCND3 mutation recurrence to identify new genes involved in leukemogenesis. Materials and methods. Bone marrow samples from 272 children with T-ALL obtained at the time of first diagnosis were analyzed with Sanger sequencing for PTEN mutations. Activating NOTCH1 mutations were detected by Sanger sequencing of the exons coding for the heterodimerisation (HD), PEST and TAD domains. Activating IL7R mutations were analyzed by Sanger sequencing and deep-amplicon sequencing of 227 T-ALL patients. The exome from 8 children with T-ALL diagnosis high-risk and related control was analyzed by Ion Torrent Technology. Finally, CCND3 mutations were analyzed in 80 T-ALL patients at diagnosis by Sanger sequencing. Results. The frequency of PTEN and NOTCH1 alterations was 12% and 65% respectively. The survival analysis on the total cohort on T-ALL patients shows a higher incidence of relapse and a lower survival in patients with inactivating PTEN mutations. Kaplan-Meyer estimate of event free survival (EFS) show a positive prognostic significance of NOTCH1 mutations in AIEOP T-ALL total cohort, but this result is not confirmed in the last therapeutic protocol analyzed AIEOP ALL2009. Because the only detectable difference between this cohort and those described in the literature is the treatment that has been applied, we hypothesize that the effect of NOTCH1 and PTEN mutational status on the risk of relapse depends on the treatment applied. By deep-sequencing the IL7R clonal mutations have been identify with great sensitivity, even if the frequency of the mutation was less than 10%. Finally, the Ion Proton System technology identified a missense mutation in CCND3 gene, this mutation have shown a recurrence 6% within a larger cohort of T-ALL by Sanger sequencing. Conclusions. In the patient cohort that has been analyzed, the PTEN mutation were correlated with outcome and were generally important for patients stratification in high risk groups; in contrast, the NOTCH1 mutation correlation on outcome depends on the type of therapeutic treatment adopted and is not generally useful for risk stratification. Future models of risk stratification will need to include more genetic markers. Preliminary results of IL7R show that ultra deep-sequencing have allow detecting mutations at subcloanl level and it was possible follow the leukemic clone with the IL7R mutation during therapy. Finally, the identification of somatic mutations and the expression of the CCND3 gene in onset blasts suggests that these genetic alterations could help the disease progression. The future functional studies will need to evaluate the possible gain-of-function of the mutated protein in leukemic blasts and to provide a new therapeutic target.

Presupposti. La leucemia linfoblastica acuta (ALL) E' la più frequente patologia neoplastica dell'età  pediatrica ed è generalmente caratterizzata da una buona prognosi, con un tasso di guarigione a lungo termine di circa il 90%. La stratificazione dei pazienti in gruppi di rischio, basata su caratteristiche cliniche e risposta al trattamento, permette di sottoporre a terapia intensiva i pazienti ad alto rischio di recidiva migliorandone l'outcome, prevenendo nel contempo l'esposizione dei pazienti a basso rischio a eccessiva tossicità. L'attivazione di NOTCH1 e l'inattivazione di PTEN sono eventi frequentemente implicati nella leucemogenesi della T-ALL, così da configurarsi come possibili elementi chiave per una stratificazione del rischio su base non solo clinica, ma anche genetica. NOTCH1 è coinvolto nella regolazione trascrizionale di IL7R, gene noto mutato in circa il 10% dei casi di T-ALL. In aggiunta, il NOTCH1 signaling è coinvolto anche nella regolazione dell'espressione della ciclina D3. Questa proteina implicata nella proliferazione cellulare, è necessaria per lo sviluppo della T-ALL. Infine, studi recenti identificano nuove alterazioni genetiche associate alla prognosi e che possono quindi essere utilizzate per la stratificazione dei pazienti, nonchè per una terapia mirata. In questo contesto, risulta interessante l'identificazione di nuove mutazioni che potrebbero avere un ruolo nella leucemogenesi. Scopo dello studio. Lo scopo principale di questo studio è la definizione del potere prognostico delle alterazioni dei geni NOTCH1 e PTEN nella T-ALL pediatrica. A questo fine, è stato analizzato, in una grande coorte di pazienti trattati secondo il protocollo AIEOP ALL2000/R2006 e AIEOP ALL2009, il profilo mutazionale di NOTCH1 e PTEN, correlandolo poi con l'incidenza di ricaduta e la sopravvivenza libera da eventi. Il secondo obiettivo oggetto di studio è l'utilizzo delle mutazioni somatiche come marcatore genetico specifico della cellula tumorale utilizzando le tecniche di sequenziamento di nuova generazione per identificare la presenza di cellule residue nel midollo osseo durante la terapia. A tale scopo, è stato analizzato lo stato mutazionale di IL7R alla diagnosi e al giorno +33 di terapia, in un ampia coorte di pazienti che seguono il protocollo AIEOP ALL2000/R2006, confrontandola con l'analisi in RQ-PCR della MRD agli stessi time point. Infine, per identificare nuovi geni implicati nella patogenesi della leucemia, nel lavoro è stata analizzata la ricorrenza di mutazione di CCND3. Materiali e metodi. Campioni di midollo osseo, ottenuti al momento della diagnosi da 272 pazienti affetti da T-ALL, sono stati analizzati con Sanger sequencing allo scopo di identificare le mutazioni di PTEN. Mutazioni attivanti di NOTCH1 sono state invece ricercate con Sanger sequencing degli esoni codificanti per i domini HD, PEST e TAD. Mutazioni attivanti IL7R sono state analizzate mediante Sanger sequencing e deep-amplicon sequencing in 227 pazienti T-ALL. L'esoma della diagnosi T-ALL e del relativo controllo di 8 pazienti alto rischio è stato analizzato mediante Ion Torrent Technology. Infine, le mutazioni di CCND3 sono state ricercate mediante Sanger sequencing alla diagnosi di 80 pazienti T-ALL. Risultati. La prevalenza delle mutazioni di PTEN e NOTCH1 è risultata rispettivamente pari a 12% e 65%. L'analisi della sopravvivenza mostra una più alta incidenza di ricaduta ed una sopravvivenza inferiore nei pazienti con mutazioni inattivanti PTEN. Al contrario, l'analisi della sopravvivenza basata sulla presenza della mutazione in NOTCH1 mostra un significato prognostico positivo in event free survival (EFS) nella corte AIEOP T-ALL totale, ma lo stesso risultato non si osserva nei pazienti trattati con l'ultimo protocollo terapeutico analizzato AIEOP ALL2009. Poichè l'unica differenza evidenziabile tra questa coorte e quelle descritte in letteratura consta nella tipologia di trattamento, si ipotizza che l'impatto prognostico di PTEN e NOTCH1 dipenda dal protocollo terapeutico utilizzato. Mediante deep-sequencing sono state identificare le mutazioni clonali di IL7R con grande sensibilità anche quando la frequenza di mutazione è inferiore al 10%. Infine, mediante Ion Proton System technology è stata identificata una mutazione missenso nel gene CCND3 con una ricorrenza, verificata in Sanger sequencing, del 6% all'interno di una più ampia coorte di T-ALL. Conclusioni. Nella coorte di pazienti analizzata, la presenza della mutazione in PTEN incide sull'outcome e lo screening per le alterazioni di questo soppressore tumorale sembra pertanto utile per la stratificazione dei pazienti in gruppi di rischio alto. Al contrario, la correlazione della mutazione in NOTCH1 con l'outcome sembra dipendere dal tipo di trattamento terapeutico utilizzato e lo screening per le alterazioni di questo pathway non sembra pertanto utile per la stratificazione dei pazienti in gruppi di rischio. Futuri modelli di stratificazione dovranno comunque includere un maggior numero di marker genetici. Dall'interpretazione preliminare dei dati di IL7R ottenuti mediante deep amplicon sequencing è possibile affermare che la metodica consente di identificare la singola cellula tumorale anche a livello subclonale e di seguirne il decorso durante la terapia. Infine, l'identificazione di mutazioni somatiche a carico del gene CCND3 e la verificata espressione a livello dei blasti dell'esordio dei pazienti T-ALL fa supporre che queste alterazioni genetiche siano funzionali e contribuenti alla patologia. Questi risultati e i successivi studi funzionali che saranno effettuati per valutare l'eventuale gain-of-function della proteina mutata nei blasti leucemici, potranno fornire un nuovo target terapeutico di supporto agli attuali trattamenti utilizzati per la cura di questa malattia.