GENETIC, PHENOTYPIC AND PROTEOMIC CHARACTERISATION OF LOCAL CHICKEN BREEDS

In common domestic species for which varieties, strains or breeds are in danger of extinction, the population levels at which action needs to be taken are object of research in many countries. Different approaches have been developed and exploited to understand the different aspects that contribute to breed differentiation and to study the typical products that originate from them. The thesis is made up of three contributes. The objectives of the first one were to determine genetic variation and to analyze population structure in six Italian local chicken breeds involved in a conservation program. Twenty microsatellite markers were investigated in 337 animals belonging to six breeds: Ermellinata di Rovigo, Robusta Maculata, Robusta Lionata, Pepoi, Padovana and Polverara; a commercial layer cross was used as reference. One-hundred-twelve alleles were detected in the overall population, with a mean number of 5.6 ± 2.1 alleles per locus. For the local breeds, the observed and expected heterozigosity ranged from a minimum of 0.240 to a maximum of 0.413 and from 0.243 to 0.463 for the Pépoi and Polverara breeds, respectively. Deviation from Hardy-Weinberg equilibrium has been observed in five breeds and in the commercial cross. The overall population heterozygote deficiency FIT, resulted 0.427, the average FIS 0.097, while FST was 0.437, indicating a high heterozygote deficiency mainly due to breed subdivisions. Reynolds distances were used to draw an unrooted Neighbor-Joining tree, which topology gave information on the genetic origin of these breeds and confirmed their known history. The estimated molecular kinship within breed ranged from 0.559 to 0.769, evidencing high coancestry. Structure analysis was performed to detect the presence of population substructures. Inferred clusters corresponded to the different breeds, without presence of admixture. Exception was the Polverara, for which a more complex genetic structure was found. Obtained results confirmed the usefulness of molecular markers, as microsatellites, to characterize local breeds and to monitor genetic diversity in livestock conservation schemes. The objective of the second contribute was to describe carcass characteristics and qualitative meat traits of three local chicken breeds showing, at maturity, light, medium-light, and medium live weights. By the fact, those breeds could permit to extend and diversify consumer’s offer to fit all the local demands in typical diversified poultry products. The experiment involved 60 male chickens reared in an organic production system where housing was an indoor pen with access to a grass paddock was carried out in order to investigate carcass characteristics and qualitative meat traits of three slow-growing Italian local breeds of chicken (Ermellinata, Padovana, and Pépoi). Chicks were randomly selected at hatch, raised together under the same conditions, slaughtered at 190 days of age, dissected for carcass traits and meat was stored for subsequent analysis of breast and thigh meat quality. Ermellinata chickens were consistently heavier than Padovana and Pépoi chickens for live, carcass, thigh weight and there were differences among breeds for protein percentage (Ermellinata > Pépoi and Padovana), shear force (Padovana < Ermellinata and Pépoi), and cooking loss (Pépoi > Padovana and Ermellinata). The CIE system values of lightness (L*), redness (a*), and yellowness (b*) evidenced a distinctive darker and lighter colour of Padovana for meat and skin, respectively. Fatty acid composition of breast was similar among the studied breeds, while saturated and monounsaturated fatty acids contents of Ermellinata were higher and lower, respectively than the other breeds. Aim of the third study was to apply a proteomic approach for characterization of local chicken breeds. The experiment involved a total of 29 males of Pépoi, Padovana, and Ermellinata local chicken breeds. Samples were taken from breast muscle (Pectoralis superficialis). Sarcoplasmic protein fractions of breast muscle were analysed by bidimensional electrophoresis. Image analysis followed by statistical analysis enabled to differentiate groups of individuals on the similarities of protein expression. Individuals were distinguished into clusters and groups, corresponding to the breed of origin. SAM analysis enabled identification of the most relevant spots; 10 of these were identified by Mass Spectrometry revealing preliminary evidences on the mechanics of the breed differentiation process. Results evidenced a possible utilisation of proteomic approach in the field of breed characterization studies as an alternative to genomic analyses performed using molecular markers, both for breed and product traceability purposes.

Nelle comuni specie domestiche, alcune razze, varietà o popolazioni risultano a rischio di estinzione. Molte di queste, per le quali si devono prendere provvedimenti, sono oggetto di studio e ricerca in molti paesi. Numerosi approcci sono stati sviluppati ed utilizzati per comprendere i diversi aspetti che contribuiscono alla differenziazione delle razze e per lo studio dei prodotti che da esse derivano. Questa tesi risulta costituita di tre contributi. Gli obbiettivi del primo riguardavano lo studio della variabilità genetica e l'analisi della struttura di popolazione in sei razze locali italiane di pollo coinvolte in un progetto di conservazione. Sono stati analizzati venti marcatori microsatellite in 337 animali appartenenti a sei razze diverse: Ermellinata di Rovigo, Robusta Maculata, Robusta Lionata, Pépoi, Padovana e Polverara; una linea commerciale ovaiola è stata utilizzata come riferimento. Sono stati rilevati centoventi alleli nel campione complessivo, con un valore medio di 5.6 ± 2.1 alleli per locus. Per quanto riguarda le razze locali, l’eterozigosi osservata variava da un minimo di 0.240 ad un massimo di 0.413 e l’attesa da 0.243 a 0.463, rispettivamente per le razze Pépoi e Polverara. Sono state osservare deviazioni dall'equilibrio di Hardy-Weinberg per cinque razze oltre che per l'incrocio commerciale. Nell’insieme, la deficienza complessiva di eterozigoti nella popolazione (FIT) risultava 0.427, il valore medio di FIS 0.097, mentre l'FST era 0.437, indicando un alta deficienza di eterozigoti dovuta soprattutto alla suddivisione in razze. Sono state utilizzate le distanze di Reynolds per tracciare un albero Neighbour-Joining unrooted, la cui topologia ha fornito informazioni sull'origine genetica di queste razze e ha confermato la loro storia conosciuta. La kinship molecolare stimata entro razza variava da 0.559 a 0.769, evidenziando un alto valore di coancestry. L'analisi della struttura è stata effettuata per evidenziare la presenza di sottostrutture nella popolazione. I cluster ottenuti dividevano chiaramente gli animali in gruppi corrispondenti alle diverse razze, senza mescolanza. Eccezione a questa situazione erano gli animali appartenenti alla razza Polverara, per la quale è stata riscontrata una struttura genetica più complessa. I risultati ottenuti hanno confermato l'utilità di marcatori molecolari come i microsatelliti per la caratterizzazione delle razze locali e per il monitoraggio della diversità genetica negli schemi di conservazione degli animali domestici. L'obiettivo del secondo contributo è stato di descrivere le caratteristiche della carcassa e i caratteri qualitativi della carne di tre razze locali di pollo che mostravano, alla maturità, pesi vivi medi, medio leggeri e leggeri. In particolare, lo sfruttamento commerciale delle razze analizzate potrebbe permettere di estendere e diversificare l'offerta ai consumatori locali che richiedono prodotti avicoli diversificati. L'esperimento ha coinvolto 60 polli di sesso maschile allevati in un sistema di produzione di tipo biologico, con accesso ad un areale esterno a prato, con l'obiettivo di studiare le caratteristiche della carcassa e i caratteri qualitativi della carne di tre razze locali italiane a lento accrescimento (Ermellinata, Padovana, and Pépoi). Gli esemplari sono stati scelti a caso alla schiusa, allevati assieme nelle stesse condizioni e macellati a 190 giorni di età. Dopo aver misurato i parametri qualitativi della carcassa, sono stati analizzati campioni di petto e di coscia. La razza Ermellinata è risultata consistentemente più pesante che la Padovana e la Pépoi in termini di peso vivo, il peso della carcassa e della coscia; inoltre si riscontravano differenze nella la percentuale di proteina (Ermellinata > Pépoi and Padovana), per quanto riguarda lo sforzo di taglio (Padovana < Ermellinata and Pépoi) e la perdita di cottura (Pépoi > Padovana and Ermellinata). I valori di luminosità (L*), indice del rosso (a*) e indice del giallo (b*), che fanno parte del sistema CIE, hanno evidenziato un colore più chiaro della carne e più scuro della pelle della pelle della Padovana. La composizione degli acidi grassi del petto è risultata similare tra le razze studiate, mentre nella razza Ermellinata è stato riscontrato un contenuto di acidi grassi saturi maggiore e un contenuto di monoinsaturi minore che nelle altre razze. Infine, l'obiettivo del terzo contributo è stata l’applicazione di un approccio proteomico allo studio e alla caratterizzazione delle razze locali di pollo. L'esperimento ha coinvolto un totale di 29 esemplari maschi appartenenti alle razze locali Pépoi, Padovana ed Ermellinata di Rovigo. Sono stati quindi analizzati campioni del muscolo pettorale (Pectoralis superficialis). Le frazioni contenenti la classe delle proteine sarcoplasmiche sono state analizzate tramite elettroforesi bidimensionale. L'analisi di immagine, coadiuvata dall'analisi statistica, ha permesso di differenziare gli individui in gruppi, sulla base delle similarità nell'espressione proteica. Gli individui sono stati suddivisi in cluster e gruppi corrispondenti alla razza di appartenenza. L'analisi SAM ha permesso l'individuazione degli spot più rilevanti, 10 dei quali sono state identificati tramite Spettrometria di Massa evidenziando, seppur preliminarmente, i meccanismi dei processi che regolano la differenziazione fra razze. I risultati hanno dimostrato un possibile utilizzo dell'approccio proteomico nel campo degli studi riguardanti la caratterizzazione di razza, e nel campo della tracciabilità di razza o dei prodotti derivati, come alternativa alle analisi genetiche effettuate tramite i marcatori molecolari.