Ca2+ homeostasis in familial Alzheimer's disease: a view from intracellular Ca2+ stores

Familial Alzheimer's disease (FAD) -linked mutations in presenilin 1 and 2 (PS1, PS2) have been causally implicated in neurodegeneration and eventually neuronal cell death by amyloid toxicity and perturbation of cellular Ca2+ homeostasis. The mechanism governing this latter phenomenon remains unclear. In the cytosol, upon stimulation, both exaggerated and reduced Ca2+ release have been reported in different cell lines and neurons expressing PS1 and PS2 mutants. Despite the contradicting data yet available, it is undisputable that FAD-linked PS mutants cause imbalances of cellular Ca2+ homeostasis. Recent independent reports have strongly suggested that the FAD-linked PS1 and PS2 mutants interact directly or indirectly with both the ER Ca2+ uptake and release machinery by modulating SERCA pump, IP3R- and RyR channel activity. In the study described here, we took advantage of two available lines of transgenic (tg) mice expressing a mutant PS2 alone or together with a mutant amyloid precursor protein (APP) - both linked to FAD - in order to investigate its effects on Ca2+ homeostasis in a physiological environment more relevant to the pathology under study. We particularly focused our attention on Ca2+ dysregulation in cortical neurons from tg mice either single homozygous for human PS2-N141I or double homozygous for human PS2-N141I and human APP swedish mutations. Ca2+ measurements were carried by the fura-2/AM technique. This study highlights the role of PS2-N141I in modulating Ca2+ homeostasis of cortical neurons. We have demonstrated that, irrespective of the presence of mutant APP, modest expression of PS2-N141I altered the Ca2+ dynamics of intracellular stores. The total Ca2+ content of intracellular stores is partially depleted, as demonstrated by reduced Ca2+ release upon ionomycin stimulation. Consequently, the tg neurons have reduced Ca2+ release in response to IP3-generating agonists. However, the PS2 mutant does not affect the protein expression levels for both SERCA pump and IP3Rs. Our results suggest that the PS2-N141I FAD mutant causes a functional defect in ER Ca2+ entry/exit pathways. We also show that both tg neurons express very low levels of the mutant protein but show Ca2+ dysregulation, similar quantitatively and qualitatively to that previously reported in cell lines upon transient over-expression of the same mutant protein. Conversely, measurements of Ca2+ release via RyRs revealed a novel and unexpected finding in PS2 mutant tg mice i.e. increased Ca2+ release in response to caffeine. In addition, RyR2 protein expression level was elevated in tg neurons. Upregulation of RyRs function and protein levels could save as an adaptation phenomenon to compensate the reduction in Ca2+ release via IP3Rs or a direct effect of mutant PS2 on RyR or a secondary effect. Furthermore, PS2-N141I causes alteration in neuronal Ca2+ excitability. The tg neurons had significantly elevated number of picrotoxin-evoked synchronous Ca2+ oscillations, which required extracellular Ca2+ influx but not Ca2+ release from intracellular stores. Interestingly, while Ca2+ dysregulation appeared to be similar qualitatively and quantitatively in both single and double tg mouse models, the total amount of brain Ab42 and Ab40 peptides (ELISA) as well as their ratios were strikingly different between the two tg lines. These results strongly suggest that in tg mice the expression of mutant APP and/or Ab levels have no primary effect on the store Ca2+ content at this early stage and provide evidence that the quite similar effects on Ca2+ dynamics observed in both tg mice are due to the mutant PS2. Finally, results presented in this work suggest that although Ca2+ dysregulation is an early event in FAD, it does not affect neuronal response and vulnerability to cytotoxic stimuli at this early stage. The second part of this study focused on the role of Ab42 oligomers in cellular Ca2+ dynamics. Synthetic Ab42 oligomers reduced Ca2+ release in response to IP3 generating agonists in wt neurons but did not affect the total Ca2+ content as monitored by ionomycin. Conversely, Ab42 oligomers increased the Ca2+ release induced by caffeine. It is likely that Ab42 oligomers exert their effect on the activation pathway from IP3 generating agonists to IP3Rs. However, the mechanisms through which Ab42 deranges intracellular Ca2+ homeostasis require further investigation. Nonetheless, it is conceivable that in addition to Ab42 oligomers, also intracellular Ca2+ stores could become likely therapeutic targets in FAD and AD in general

E stato dimostrato che mutazioni in presenilina 1 e 2 (PS1, PS2) legate alle forme familiari della malattia di Alzheimer (FAD) sono implicate nella neurodegenerazione e in ultima istanza nella morte cellulare per effetto della tossicità del peptide amiloide e della perturbazione dell'omeostasi del Ca2+ cellulare. Il meccanismo alla base di quest'ultimo fenomeno non è ancora stato chiarito. Si è visto che in linee cellulari e in neuroni esprimenti mutazioni in PS1 e PS2, il rilascio di Ca2+ nel citosol in seguito a stimolazione cellulare può essere sia aumentato che ridotto. Nonostante i dati contraddittori attualmente disponibili, è innegabile che i mutanti di PS legati a FAD provocano uno squilibrio nell'omeostasi del Ca2+ cellulare. Recentemente studi indipendenti hanno dimostrato che i mutanti FAD in PS1 o PS2 interagiscono sia con i meccanismi di rilascio che di accumulo di Ca2+ nel reticolo endoplasmatico (RE), modulando sia l'attività  della pompa SERCA che i canali di tipo IP3R e RyR. In questo studio abbiamo impiegato due linee già  disponibili di topi transgenici (tg) esprimenti una PS2 mutata, da sola o assieme alla Proteina Precursore dell'Amiloide (APP) (entrambe con mutazioni legate a FAD) al fine di investigarne gli effetti sull'omeostasi del Ca2+ in una condizione fisiologica più rilevante per la patologia oggetto dello studio. Abbiamo focalizzato in particolare la nostra attenzione sull'alterazione del Ca2+ in neuroni corticali ottenuti da topi tg omozigoti per il solo mutante PS2-N141I o doppi omozigoti per le proteine mutate PS2-N141I e APPswe. Le misure di Ca2+ sono state effettuate con la tecnica del Fura-2/AM. Questo studio mette in evidenza il ruolo della PS2-N141I nel modulare l'omeostasi del Ca2+ in neuroni corticali murini. Abbiamo dimostrato che, indipendentemente dalla presenza del mutante di APP, l'espressione della PS2-N141I, in quantità  moderata, inficia le dinamiche del Ca2+ dei depositi intracellulari. In particolare,i depositi del Ca2+ sono parzialmente svuotati, come dimostrato dal ridotto rilascio di Ca2+ in seguito a stimolazione con ionomicina. Conseguentemente i neuroni tg hanno un ridotto rilascio di Ca2+in risposta ad agonisti legati alla generazione di IP3. Occorre notare che la PS2 mutata non altera i livelli di espressione delle proteine SERCA e IP3R. I nostri risultati suggeriscono che il mutante FAD PS2-N141I causa un difetto funzionale nelle vie di entrata e di uscita del Ca2+ dal RE. Abbiamo inoltre dimostrato che i neuroni di entrambe le linee tg esprimono bassi livelli di proteina mutante ma mostrano un'alterazione del segnale Ca2+ qualitativamente e quantitativamente simile a quella precedentemente riportata per le linee cellulari sovra-esprimenti la stessa proteina. Al contrario, misure del rilascio di Ca2+ via RyR hanno rivelato un effetto inatteso, ovvero un aumentato rilascio di Ca2+ in risposta a caffeina nei neuroni tg. Inoltre, i livelli proteici di RyR2 sono aumentati nei neuroni tg. Un aumento della funzionalità  e dei livelli proteici di RyR2 potrebbero essere un fenomeno adattativo per compensare la riduzione del rilascio di Ca2+ via IP3R oppure essere un effetto diretto dei mutanti PS2 su RyR2 o ancora un effetto secondario. Infine abbiamo dimostrato che la PS2-N141I causa un'alterazione nell'eccitabilità  neuronale. I neuroni tg hanno un numero significativamente più elevato di oscillazioni di Ca2+ sincronizzate, evocate da picrotossina, che dipendono dall' ingresso di Ca2+ extracellulare e non dal rilascio di Ca2+ dai depositi. E interessante notare che, mentre l'alterazione del Ca2+ è qualitativamente e quantitativamente simile nei singoli e doppi tg, sia il livello totale di peptidi Ab42 e Ab40 nel tessuto cerebrale (misurati mediante ELISA) che il loro rapporto sono notevolmente diversi tra le due linee tg. Questi risultati suggeriscono che nei topi tg l'espressione di APP mutata o i livelli di Ab non hanno alcun effetto primario sul contenuto dei depositi di Ca2+ in questo stadio precoce, e suggeriscono che gli effetti sulle dinamiche del segnale Ca2+, così simili nelle due linee tg, siano dovuti alla PS2 mutata. Infine, i risultati qui presentati suggeriscono che nonostante l'alterazione del segnale Ca2+ sia un evento precoce nei neuroni a questo stadio, non altera la vulnerabilità  neuronale a stimoli citotossici che agiscono atrraverso i depositi del Ca2+ . La seconda parte di questo studio si è concentrata sul ruolo degli oligomeri di Ab42 sulle dinamiche del Ca2+ cellulare. Nei neuroni di topi wt, oligomeri di Ab42 sintetico riducono il rilascio di Ca2+ in risposta ad agonisti legati alla produzione di IP3, ma non riducono il contenuto totale di Ca2+ dei depositi misurato mediante applicazione di ionomicina. D'altra parte, gli oligomeri di Ab42 aumentano il rilascio di Ca2+ indotto da caffeina. E' probabile che gli oligomeri di Ab42 agiscano sulla via attivata dagli agonisti legati alla produzione di IP3 e sull' IP3R. I meccanismi attraverso cui Ab42 altera l'omeostasi intracellulare del Ca2+ richiedono tuttavia ulteriori indagini. In conclusione, oltre agli oligomeri di Ab42 anche i depositi intracellulari di Ca2+ possono diventare un importante bersaglio terapeutico per intervenire sulla patologia di Alzheimer familiare ma anche sulla forma sporadica