Three years of surveillance (2008-10) for the assessment of contaminants residues in milk produced in Kosovo

This paper describes the survey on anti-microbial agents and Mycotoxins in milk as part of a large study to assess public health hazards associated with marketed milk. Samples were collected seasonally during 2008-2010 from individual farms, milk collection points and milk from retail markets (UHT milk). All samples were screened for antimicrobial residues using Delvotest SP (DSM Food Specialties, The Netherlands), Snap tests (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine USA) and Penicillin ELISA test (Immunolab, Germany). The former detects a wide range of anti-microbial, and the latter detects β-lactams and tetracycline‟s specifically, at levels above maximum residue limits (MRLS) recommended by the European Union (EU). In this study a total of 1895 milk samples were analyzed by Delvotest SP screening test and all of the positive samples were tested by two screening tests and two confirmatory tests were done to evaluate the contamination of antibiotics during 2008-2010. Positive milk samples yield by Delvotest SP were then tested by Snap beta-lactam test (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine USA) 106 tests, Snap tetracycline test 106 tests, snap sulphamethasine test 106 tests, and Penicillin ELISA test (Immunolab, Germany) 37 tests. The confirmatory analytical methods applied to 80 sample extracts (reacted positive at screening methods). The qualitative examination of antibiotic residues in 1895 milk samples, during a three year period (2008 to 2010), led to the identification of 131 positive samples (6.91%), 5 ambiguous samples (0.26%) and 1759 negative samples (92.82). In 2008, 25(15.52%) out of 161 samples were positive, in 2009, 52(5.12%) out of 1015 samples were positive and in 2010 54(7.51%) out of 719 samples were positive. Of all 1895 samples 131(6.91%) were positive for antibiotic residues in cow raw milk in the regions of Kosovo. From 69 UHT milk samples analyzed during 2009 to 2010 two samples were found positive. The confirmatory analytical methods applied to 80 sample extracts (reacted positive at screening methods) confirmed the presence of tetracyclines (oxytetracycline, tetracycline) by LC-DAD in 5 samples (3 of them with concentration > MRL), the presence of sulfonamides (sulfadiazine, sulfathiazole, sulfamethazine and sulfamethaxazole) by LC-MS in 8 samples (all of them with concentration < MRL) and the presence of beta-lactams (amoxicillin, penicillin G, cefazolin and cloxacillin) by LC-MS in 46 samples (21 of them with concentration > MRL). The main identified antibiotic families were betalactams (in 90.07% of samples) in average concentrations of 478.22 μg/kg, tetracyclines (in 3.82% of samples) in average concentrations of 14936.66 μg/kg Sulphonamides in (6.11% samples) in average concentration of 7.26 μg/kg. During 2009 and 2010 the survey on the presence of AFM1 in milk in Kosovo has been performed. In this study 895 milk samples were analyzed by two different screening tests to evaluate the contamination of aflatoxin M1 during 2009-2010 sample collected from individual farms, milk collection points and milk from retail markets. Milk samples (695) in 2009, and (200) in 2010 were tested by ELISA test (Tecna srl, Trieste, Italy), and 9 samples (2009), and 37 samples (2010) were tested with SNAP Afla M1 test (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine USA). In 2009 from a total of 895 samples examined 20 samples were contaminated with AFM1, positive reaction in tests had 20 samples or (2.88%) out of 695 samples, and 675 (97.12%) were negative, in 2010 from 200 samples in total examined 5 (2.5%) samples reacted positive, and 195 (97.5%) samples reacted negative. In 2009, the AFM1 concentrations in 695 samples (97.12%) were less than 5 ng/L wail in 20 samples (2.88%) AFM1 was found between 5 and 50 ng/L. In those positive samples AFM1 concentration in milk was in range between 5-10 ng/L (10 samples), 10-25 ng/L (9 samples), and 25-50 ng/L (1 sample). Samples tested with Snap afla M1 test were negative (these samples were randomly selected from positive samples on antibiotics). In 2010, results derived by ELISA test showed that in 195 samples (97.50%) the AFM1 concentrations were less than 5 ng/L and in 5 samples (2.50%) AFM1 was found between 5 and 10 ng/L. All tested samples with SNAP Afla M1 test were negative. In 2009, the highest concentration of aflatoxin was registered in one October sample which contained 26.59 ng/L. We found the highest number of positive samples in summer (8 samples) and autumn (12 samples). The region where the majority of contaminated samples were found is Peja region while Mitrovica region was without contaminated samples. In 2010, in terms of seasonal distribution, we found the highest number of positive samples in winter (three samples), spring (one sample) and in autumn (one sample). The highest concentration of aflatoxin was registered in one spring sample; it contained 9.81 ng/L, in winter samples ranged between 6.60 and 8.58 ng/L and one sample in autumn contained 6.70 ng/L. The region where all of the contaminated samples were found is Peja region with 100% positives and with no contamination with Aflatoxin M1 in other surveyed regions of Kosovo. Milk samples were taken throughout January to September to study a possible seasonal influence. At the present study, AFM1 levels were detected in UHT milk in both 2009/2010.

Oggetto di questo lavoro di tesi è stata la ricerca di agenti antimicrobici e di micotossine nel latte presente nel mercato in Kosovo allo scopo di valutare i rischi per la salute pubblica associati al consumo del latte stesso. I campioni di latte sono stati raccolti stagionalmente nel periodo 2008-2010 dalle singole fattorie, dai centri di raccolta del latte e dai supermercati locali (campioni di latte UHT) di diverse regioni del Kosovo. Tutti i campioni sono stati analizzati, per la ricerca di residui di antimicrobici, con metodi di screening quali: Delvotest SP (DSM Food Specialties, The Netherlands) in grado di rilevare un ampio range di antimicrobici, Snap tests (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine USA) e Penicillin ELISA test (Immunolab, Germany) in grado di rilevare, in modo specifico, la presenza di tetracicline o beta-lattamici a livelli al di sopra dei limiti massimi residuali (LMR) raccomandati dall‟Unione Europea. In questo studio, un totale di 1895 campioni di latte raccolti tra il 2008 e il 2010 sono stati analizzati con il Delvotest SP: 106 campioni risultati positivi sono stati sottoposti ad ulteriori test di screening quali SNAP test specifici per le tetracicline, per i beta-lattamici (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine USA) e per i sulfamidici e 37 campioni sono stati sottoposti a test ELISA per le Penicilline (Immunolab, Germany) per risalire alla classe di antibiotico presente. Per la determinazione quantitativa dei residui di antimicrobici, invece, 80 campioni risultati positivi ai metodi di screening sono stati sottoposti ad analisi con metodi di conferma quali LC-DAD per tetracicline e LC-MS per beta-lattamici e sulfamidici. L‟analisi qualitativa dei residui di antimicrobici presenti nei campioni raccolti tra il 2008 e il 2010, ha portato all‟identificazione di 131 campioni positivi (6.91%), a 5 campioni “dubbi” (0.26%) e a 1759 campioni negativi (92.82%). Nel 2008, 25 campioni dei 161 raccolti (15.52%) sono risultati positivi, nel 2009, 52 campioni dei 1015 (5.12%) sono risultati positivi, mentre nel 2010 i campioni che hanno dato esito positivo sono stati 54 (il 7.51%). Tutti i campioni positivi per la presenza di antibiotici sono risultati essere campioni di latte fresco non pastorizzato mentre, dei 69 campioni di latte di tipo UHT raccolti tra il 2009 e il 2010, solo 2 hanno dato esito positivo. I metodi analitici applicati a 80 campioni risultati positivi ai metodi di screening, hanno confermato la presenza di tetracicline (ossitetraciclina e tetraciclina) in 5 campioni (3 dei quali con concentrazioni > LMR), la presenza di sulfamidici (sulfadiazina, sulfatiazolo, sulfametazina e sulfametossazolo) in 8 campioni (tutti con concentrazioni al di sotto dell‟LMR) e la presenza di beta-lattamici in 46 campioni (21 campioni con concentrazioni > LMR). Nel 2009 e nel 2010 è stata valutata inoltre la presenza di aflatossina M1 in 895 campioni di latte raccolti dalle fattorie, dai centri di raccolta e dai supermercati locali del Kosovo. Sono stati utilizzati due diversi test di screening per valutare la contaminazione di aflatossina M1: tutti i 695 campioni di latte raccolti nel 2009 e i 200 raccolti nel 2010 sono stati analizzati con il test ELISA (Tecna srl, Trieste, Italy) mentre 9 campioni del 2009 e 37 del 2010 (scelti casualmente tra quelli risultati positivi) sono stati testati anche con il test SNAP Afla M1 (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine USA). Nel 2009, 20 campioni dei 695 totali (2.88%) sono risultati contaminati da aflatossina M1: 10 campioni con concentrazioni tra 5-10 ng/L, 9 campioni con concentrazioni tra 10-25 ng/L e 1 campione con concentrazioni tra 25-50 ng/L. I 675 campioni risultati negativi hanno presentato concentrazioni inferiori ai 5 ng/L. Nel 2010, i risultati ottenuti con il test ELISA hanno rilevato la presenza di aflatossina M1 in 5 dei 200 campioni analizzati (2.50%), con concentrazioni comprese tra 5 e 10 ng/L. Tutti i campioni analizzati con il test SNAP Afla M1 sono risultati negativi. Nel 2009, la concentrazione più alta di aflatossina (26.59 ng/L) è stata registrata in un campione raccolto nel mese di ottobre. Il maggior numero di campioni positivi si è registrato in estate (8 campioni) e in autunno (12 campioni) e la regione con il maggior numero di campioni contaminati è risultata Peja. Mitrovica, invece è la regione in cui non si sono registrate positività. Nel 2010, in termini di distribuzione stagionale, 3 campioni positivi sono stati raccolti in inverno (concentrazioni tra 6.60 e 8.58 ng/L), 1 campione positivo in primavera (campione che ha presentato anche la concentrazione più alta, 9.81 ng/L) e 1 in autunno (6.70 ng/L). Anche nel 2010, tutti i campioni risultati positivi per l‟aflatossina M1, sono stati raccolti nella regione Peja.