Cell death regulation by mitochondrial chaperones in tumor cell models

Cancer cells are endowed with the capability to evade normal apoptotic signaling, as they display a constitutive hyperactivation of kinase signaling pathways. Integration of survival and death stimuli occurs on mitochondria, where many of these signals converge in the regulation of a channel termed permeability transition pore (PTP). PTP opening commits cells to death, and it is regulated by a variety of factors, among which molecular chaperones play a pivotal role. Here I have studied how mitochondrial chaperones interact with signal transduction pathways, modulate the PTP and more in general mitochondrial bioenergetics, and how these regulatory networks control tumor cell viability. In a first part of my work, I have explored a functional connection between the Ras/ERK signaling axis, whose constitutive activation characterizes most tumors and prompts their growth and survival, and cyclophilin D (CyP-D), a mitochondrial chaperone that regulates the PTP. A fraction of active ERK was found to be located in mitochondria in RWPE-2 cells, obtained by v-Ki-Ras transformation of the epithelial prostate RWPE-1 cell line; in metastatic prostate cancer DU145 cells; and in osteosarcoma SAOS-2 cells. All these tumor cells displayed marked resistance to death caused by apoptotic stimuli like arachidonic acid and the BH3 mimetic EM20-25, which cause cell death through the mitochondrial PTP. PTP inhibition and the ensuing resistance to cell death induced by arachidonic acid or EM20-25 could be ablated by inhibiting ERK with the drug PD98059 or with a selective ERK activation inhibitor peptide. ERK inhibition enhanced GSK-3-dependent phosphorylation of CyP-D), whereas GSK-3 inhibition protected from PTP opening. Neither active ERK in mitochondria nor pore desensitization were observed in non-transformed RWPE-1 cells. Thus, in tumor cells mitochondrial ERK activation desensitizes the PTP through a signaling axis that involves GSK-3 and CyP-D. In a second part of my thesis work, I have investigated the activity of a second mitochondrial chaperone, TRAP1/HSP75, overexpressed in tumor cells and proposed to be involved in regulation of the pore. I have determined that TRAP1 interacts with CyP-D and characterized its survival function against a wide spectrum of death stimuli inducing oxidative stress, including diamide, exposure to TNFα, and glucose deprivation. Moreover, I have found that knocking-down TRAP1 expression level through RNA interference in SAOS-2 osteosarcoma cells facilitates PTP opening, thus lowering the threshold for committing cells to death. TRAP1 modulates cell metabolism and possibly the response to oxidative stress by reducing mitochondrial respiration and the activity of respiratory chain complex I, with which TRAP1 directly interacts, both in cells and in tumor samples. Notably, down-modulation of TRAP1 ablates the tumorigenic potential of SAOS-2 cells both in vitro and in-vivo. Altogether, these data indicate that mitochondrial chaperones such as CyP-D and TRAP1 play an important role in tumor progression and constitute a possible target for anti-neoplastic intervention.

Le cellule tumorali sono caratterizzate dalla capacità di evadere il normale signale apoptotico, così come mostrano una iper-attivazione costitutiva delle vie di signale kinasico. L’integrazione degli stimoli di sopravvivenza e morte si concentra nei mitocondri, dove molti di questi segnali convergono nella regolazione di un canale chiamato poro della transizione di permeabilità (PTP). L’apertura del PTP porta le cellule alla morte ed è regolata da una varietà di fattori e fra questi gli chaperoni giocano un ruolo fondamentale. Nel mio lavoro di tesi ho studiato come gli chaperoni mitochondriali si integrano nelle vie di trasduzione del segnale , modulando il PTP e più in generale la bioenergetica mitocondriale e come questi network regolatori controllano la vitalità cellualre. Nella prima parte del mio lavoro ho studiato una possibile connessione fra la via del segnale Ras/ERK, la cui attivazione costitutiva caratterizza molti tumori favorendo la loro crescita e sopravvivenza, e la ciclofilina D (CyP-D), uno chaperone mitocondriale che regola il PTP. Una frazione di ERK attivo è stato trovato nei mitocondri delle cellule RWPE-2, ottenute tramite trasformazione con v-ki-Ras a partire da cellule dell’epitelio prostatico RWPE-1; in cellule metastatiche di tumore prostatico DU145; e in cellule di osteosarcoma SAOS-2. Tutte queste cellule tumorali mostrano una marcata resistenza alla morte indotta da stimoli pro-apoptotici come l’acido arachidonico e il BH3 mimetico EM20-25, i quali inducono la morte cellulare attraverso il PTP mitocondriale. L’inibizione del PTP e la conseguente resistenza alla morte cellulare indotta da acido arachidonico o EM-20-25 può essere abolita dall’inibizione di ERK con il farmaco PD98059 o con un peptide selettivo inibitorio di ERK. L’inibizione di ERK aumenta la fosforilazione GSK-3 dipendente della CyP-D, mentre l’inibizione di GSK3 protegge dall’apertura del poro. Ne ERK attivo nei mitocondri, ne desensibilizzazione del poro è stata osservata in cellule non trasformate RWPE-1. In conclusione, nelle cellule tumorali l’attivazione dell’ERK mitocondriale desensibilizza il PTP attraverso un asse di segnale che coinvolge GSK3 e Cyp-D. Nella seconda parte del mio lavoro di tesi, ho studiato l’attività di un secondo chaperone mitocondriale, TRAP1/HSP75, fortemente espresso nelle cellule tumorali e che è stato proposto essere coinvolto nella regolazione del poro. Ho dimostrato che TRAP1 interagisce con la CyP-D ed ho caratterizzato la sua funzione di pro-sopravvivenza nei confronti di un vasto spettro di stimoli di morte, incluso lo stress ossidativo, la diamide, il TNFα, e la deplezione di glucosio. Inoltre ho trovato che il knocking-down dei livelli di espressione di TRAP1 attraverso la tecnica dell’RNA interference in cellule di osteosarcoma SAOS-2 facilita l’apertura del PTP, abbassando la soglia per portare le cellule alla morte. TRAP1 modula inoltre il metabolismo cellulare probabilmente la risposta allo stress ossidativo e l’attività della del complesso I della catena respiratoria, con il quale TRAP1 interagisce direttamente sia in cellule che campioni tumorali. La down- regolazione di TRAP1 abolisce il potere tumori genico delle cellule SAOS-2 sia in vitro che in vivo. Tutti insieme questi dati indicano che gli chaperoni mitocondriali come CyP-D e TRAP! Giocano un ruolo importante nella progressione tumorale e costituiscono un possibile target di nuove terapie antineoplastiche.