Construction and evaluation of high-capacity adenoviral vectors for gene therapy applications

Gene therapy present a great therapeutic potential for a diversity of liver disorders including inherited metabolic conditions (phenylketonuria, tyrosinemia) and acquired diseases (chronic infections, primary and metastatic tumors). For many of these applications, vectors allowing prolonged, regulable and tissue-specific expression of the transgene would be required. Adenovirus is the most widely used vector in human clinical assay. To avoid the cellular immune response induced by first and second generation Ad, the third-generation vectors was generated, also called gutless or helper-dependent. To produce these vectors requires three basic elements: a gutless adenovirus with a therapeutic or marker gene of interest, a helper adenovirus which provide viral proteins in trans and, a cell line permissive for Ad production. Gutless adenovirus does not contain any viral region, not cellular immune response generated and can accommodate up to 36 Kbp and was demonstrated that the expression of genes that can incorporate lifelong body. In this study, two distinct gutless adenoviruses were produced, with hepatospecific and regulated expression by the RU inducible system, containing a combination of OSM and IFN genes (HCA-RUIO) and the other the hIL-12 gene (HCA-RUhIL12). After in vitro testing the correct functionality of the vectors were carried out in vivo tests in mice and hamsters. It showed that in vivo expression of gene of interest changes with the species of animal used and the transgene present in the vector. In contrast to previous data that showed in mice infected with HCA-RUmIL12 that mIL-12 can be expressed even after more than a year, in Hamsters, the same vector expressed the transgene only after the first induction with RU and then it could not be detected. The vector HCA-RUIO gave a similar pattern of expression of the transgene in both hamsters, but also in mice. This may be due to the fact that if the protein products by the vector are exogenous to the organism is activated immunostimolatory activity in animals that leads to the elimination of the transfected cells and thus an inability to reinduce the expression of the transgene.

La terapia genica presenta un grande potenziale terapeutico per una varietà di disturbi epatici tra cui patologie metaboliche ereditarie (fenilchetonuria, tirosinemia) e malattie acquisite (infezioni croniche, tumori primari e metastatici). Per molte di queste applicazioni sarebbe necessario l’utilizzo di vettori ad espressione prolungata, regolabile e tessuto-specifica del transgene. Adenovirus è il vettore più utilizzato nei trials clinici umani. Per evitare la risposta immunitaria cellulare indotta da adenovirus di prima e seconda generazione, sono stati generati i vettori di terza generazione, chiamati anche gutless o helper-dipendenti. Per produrre questi vettori sono richiesti tre elementi fondamentali: un adenovirus gutless con un gene terapeutico o marker di interesse, un adenovirus helper che fornisca proteine virali in trans e, una linea cellulare permissiva per la produzione di Ad. Gli Adenovirus Gutless, il cui genoma non contiene alcun gene virale, non genera risposta immunitaria cellulare e può ospitare fino a 36 Kbp. Hanno dimostrato che l'espressione di geni che possono incorporare può permanere per molto tempo. In questo studio, sono stati prodotti due distinti adenovirus gutless, con espressione epatospecifica e regolata dal sistema inducibile RU, contenenti una combinazione dei geni OSM e IFN (HCA-RUIO) e l'altro il gene hIL-12 (HCA-RUhIL12). Dopo la sperimentazione in vitro la corretta funzionalità dei vettori sono stati effettuati test in vivo nei topi e criceti. E’ stato dimostrato che in vivo l'espressione del gene di interesse cambia con la specie animale utilizzata e il transgene presente nel vettore. In contrasto con i dati precedenti che hanno dimostrato nei topi infettati con HCA-RUmIL12, mIL-12 può essere espresso anche dopo più di un anno, nei criceti, lo stesso vettore esprime il transgene solo dopo la prima induzione con RU e quindi non poteva essere rilevato successivamente. Il vettore HCA-RUIO ha dato un modello simile di espressione del transgene in criceti, ma anche nei topi. Ciò può essere dovuto al fatto che se le proteine prodotte dai vettori sono esogene per l'organismo si attiva l'attività immunostimolatoria negli animali che porta alla eliminazione delle cellule transfettate e quindi l'incapacità di reindurre l'espressione del transgene.