OPA1-dependent cristae remodeling disassembles respiratory chain supercomplexes, triggering apoptotic mitochondrial dysfunction

Mitochondria are key organelles in intermediatig cellular metabolism, energy production and calcium homeostasis (Rizzuto et al., 2000; Danial and Korsmeyer, 2004). They also integrate and amplify apoptosis induced by several intrinsic stimuli (Green and Reed, 1998). Their structure is extremely complex, being bound by two membranes. The inner membrane (IMM) can be further divided in two distinct compartments, the so called “boundary membrane” and the cristae, separated from the former by narrow tubular junctions. Such a functional versatility and complexity is controlled by a growing family of “mitochondria-shaping” proteins that regulate fusion and fission events of mitochondrial membranes, ultimately affecting the morphology and ultrastructure of the organelle. Optic Atrophy 1 (OPA1), the homologue of S.cerevisiae Mgm1p, is the only dynamin-related protein identified in the inner membrane (IM) so far (Olichon et al., 2002). Our laboratory discovered that OPA1 promotes mitochondrial fusion by cooperating with MFN1 (Cipolat et al., 2004), and demonstrated that OPA1 has antiapoptotic activity, genetically distinguishable from its function in mitochondrial fusion (Frezza et al., 2006). In particular we proved that OPA1 keeps the cristae junctions tight by forming oligomers that contain two forms of OPA1, one soluble in the IMS, generated by intramembrane proteolytic cleavage by the rhomboid protease PARL, and the second inserted in the IMM. In the early steps of apoptosis, the pro-apoptotic BH3-only BCL-2 family member BID disrupts these OPA1-containing oligomers and causes a remodeling of cristae structure. Conversely, high levels of OPA1 stabilize them and prevent mobilization of cytochrome c from mitochondria (Frezza et al., 2006). Notably, EM analysis and EM tomography showed that OPA1-depleted cells harbour disorganized cristae whose shape is irregular (Frezza et al., 2006), an observation supported by other experimental evidence in different cellular models that point out the importance of OPA1 in cristae morphology (Olichon et al., 2003; Griparic et al., 2004). The cristae are key mitochondrial structures: they are the site of oxidative phosphorylation where the complexes of respiratory chain are localized. Recent structural and functional evidence demonstrated that in order to improve the efficiency of electron channelling, the individual respiratory chain complexes are organized into functional and dynamic supramolecular structures referred as supercomplexes (RCS). (Acin-Perez et al., 2008) These evidence gave rise to a novel model called “plasticity model” that integrates the old “fluid” and “solid” models that have been put forward to explain the organization of the electron transport chain . While the role of cristae remodelling in the amplification of the apoptotic cascade has been established (Scorrano et al., 2002; Frezza et al., 2006; Germain et al., 2005) its consequences on mitochondrial function are unknown. The aim of this PhD thesis was to investigate if apoptotic cristae remodelling had any effect on the activity and the structure of the mitochondrial respiratory chain, and on supercomplexes (RCS),that are preferentially located in the cristae. Since the multiple changes affect mitochondria during apoptosis, including the release of cytochrome c and the activation of feedback circuits that lead to the inactivation of mitochondrial respiration, we needed to identify an inducer of apoptosis that causes all the apoptotic changes except for cristae remodeling. Analyzing the aminoacidic structure of BID, we identify a stretch of aminoacid, corresponding to the α6-helix, that displays high homology with mastoparan, a wasp venom peptide that severely perturbs mitochondrial membranes (Pfeiffer et al., 1995) and that seemed a natural candidate to exert the membrane perturbation of the cristae remodeling. A BID mutant in two conserved Lysines (K157,158) of this domain (BIDKKAA) was able to target mitochondria as well as its wt counterpart but was less efficient in inducing cytochrome c release. Crosslinking experiments revealed that the mutation in the α6-helix does not impair the oligomerization of BAK, but reduces the ability of BID to distrupt the high molecular weight complexes of OPA1, resulting in a reduction of the apoptotic rate. Thus, we capitalized on this mutant to study the effects of cristae remodeling on mitochondria physiology. Interestingly, wt BID selectively impairs complex I dependent mitochondrial respiration which is higly influenced by RCS assembly. BlueNative page (BN PAGE) confirmed that BID impacts on RCS by preventing the individual complexes from being assembled into supercomplexes, without affecting complexes. These changes were abrogated by the BID mutant that is unable to induce cristae remodeling, but not by other mutants of BID that do not trigger activation of BAX, BAK. Since the molecular basis of the assembly and stabilization of RCS are unknown, the selective impairment of RCS by cristae remodeling pointed our attention to the role of OPA1, whose oligomers are targets of BID and control cristae bioegnesis. We turned to a genetic approach and analyzed the structure and the assembly of RCS in Opa1-/- cells. First dimension BN PAGE and SDS-second dimension page revealed that the structure of RCS in Opa1 deficient cells is dramatically affected. In particular a RCS assembly assay (Acin-Perez et al., 2008) confirmed that the ordered pattern of assembly is perturbed in Opa1-/- cells, resulting in anomalous composition of RCS. BN PAGE performed with radiolabeled mt-DNA proteins revealed that the overall amount of mitochondrial protein is less in Opa1-/- than in wt cells and it correlates with the fact that Opa1-/- cells have less mt-DNA copy number a feature shared also by Mfn1-/-,2-/- cells that on the contrary display organized cristae. Of note, BN PAGE and assembly assay demonstrated that the structure of RCS is not affected in Mfn1-/-,2-/- cells. The physiological importance of RCS disassembly is substantiated by an impairment of the growth rate of Opa1-/- cells or of cells lacking Bak and Bax expressing wt, but not KKAA BID when energy production cannot bypass mitochondrial respiration. In conclusion, our data indicate that the shape of the cristae is essential for the assembly of the RCS and underline OPA1 as molecular regulator of the RCS structure. Moreover our results deepen the role of cristae remodelling during apoptosis, demonstrating that cristae remodelling affects mitochondrial respiratory efficiency and hence the program of mitochondrial dysfunction during apoptosis.

I mitocondri sono organelli fondamentali per il metabolismo cellulare, per la produzione di energia e per l’omeostasi del calcio (Rizzuto et al., 2000; Danial and Korsmeyer, 2004). Essi, inoltre, hanno un ruolo importante nella morte cellulare (definita anche apoptosi) in quanto sono fondamentali nell’amplificazione del segnale di morte indotto da diversi stimoli (Green and Reed, 1998). La loro struttura è molto complessa. Essi sono infatti circondati da una membrana esterna ed una interna. Grazie alle tecniche di microscopia elettronica è stato possibile osservare che la membrana interna presenta delle particolari strutture, denominate cristae mitocondriali. Le cristae sono dei veri e propri compartimenti distinti della membrana interna e sono separati dallo spazio intermembrana da giunzioni tubulari strette definite cristae junctions (Perkins et al., 2001; Frey and Mannella, 2000). I mitocondri sono organelli molto versatili che, grazie ad eventi di fusione e fissione, sono in grado di modificare la propria struttura e morfologia a seconda delle condizioni cellulari. Le proteine che regolano questi eventi appartengono alla famiglia delle dinamine definite mitochondrial shaping proteins. OPA1, il cui gene mutato è causa dell’atrofia dominante ottica (ADOA), è l’unica proteina della famiglia delle dinamine localizzata nella membrana interna attualmente conosciuta (Olichon et al., 2002). Nel laboratorio dove ho svolto il mio lavoro di tesi, precedentemente è stato scoperto che OPA1 promuove la fusione mitocondriale cooperando con Mitofusina 1 (MFN1) (Cipolat et al., 2004) e che inoltre possiede un ruolo anti-apoptotico, geneticamente indipendente dalla fusione mitocondriale (Frezza et al., 2006). In particolare è stato dimostrato che OPA1 controlla la morfologia delle cristae mantenendone chiuse le giunzioni grazie alla formazione di oligomeri ad alto peso molecolare. Questi oligomeri contengono la forma solubile di OPA1, generata dal taglio proteolitico da parte della proteasi di tipo romboide PARL, e dalle forme di OPA1 ancorate alla membrana mitocondriale. Nelle prime fasi del segnale di apoptosi, la proteina proapoptotica BID, appartenente alla famiglia delle proteine BCL-2, causa la destabilizzazione degli oligomeri di OPA1, provocando un drammatico rimodellamento delle cristae (cristae remodelling) necessario per la mobilizzazione del citocromo c contenuto nelle cristae. Al contrario la overespressione di OPA1 stabilizza questi oligomeri e previene la mobilizzazione del citocromo c (Frezza et al., 2006). Inoltre, con tecniche di microscopia elettronica è stato osservato che le cellule deplete di OPA1 presentano una disorganizzazione della struttura delle cristae, la cui forma appare irregolare (Frezza et al., 2006). Questa osservazione è stata avvalorata da altre evidenze sperimentali in organismi cellulari differenti che confermano l’importanza di OPA1 nella morfologia delle cristae (Olichon et al., 2003; Griparic et al., 2004). Le cristae sono strutture importanti per la fisiologia mitocondriale: sono infatti la sede della fosforilazione ossidativa dove i complessi della catena respiratoria sono localizzati. Recentemente, alcune evidenze strutturali e funzionali hanno chiarito che i singoli complessi della catena respiratoria sono organizzati in macrostrutture dinamiche chiamati supercomplessi della catena respiratoria (RCS) che aumentano l’efficienza del trasporto di elettroni (Acin-Perez et al., 2008). Da questi risultati è stato creato un nuovo modello chiamato “modello plastico” che va ad integrare i modelli “fluido” e “solido” precedentemente disegnati per spiegare l’organizzazione dei complessi della catena respiratoria. Mentre il ruolo del cristae remodeling nell’amplificazione del segnale di morte cellulare è stato ben delineato (Scorrano et al., 2002; Frezza et al., 2006; Germain et al., 2005), le sue conseguenze sulle funzioni mitocondriali sono ancora ignote. Scopo della mia tesi di dottorato è stato quello di capire se il cristae remodeling avesse alcun effetto sull’attività e la struttura della catena respiratoria e in particolare sui RCS che sono localizzati proprio sulle cristae. I mitocondri però, durante l’apoptosi, vanno incontro non solo al cristae remodeling ma ad altri numerosi cambiamenti, inclusi il rilascio di citocromo c dalla membrana esterna e l’inattivazione della respirazione mitocondriale da parte di segnali retroattivi. Per poter valutare quali fossero gli effetti specifici del cristae remodeling sulla fisiologia mitocondriale, abbiamo dovuto identificare un agente apoptotico che causasse tutti i cambiamenti apoptotici escluso il cristae remodeling. Analizzando la sequenza amminoacidica di BID, abbiamo identificato un dominio, corrispondente all’elica 6, che possiede un’elevata omologia con il mastorapan, un peptide contenuto nel veleno delle vespe che è in grado di perturbare fortemente le membrane mitocondriali (Pfeiffer et al., 1995). Per questa sua caratteristica, il mastoparan sembrerebbe un composto naturale in grado di esercitare la stessa perturbazione della struttura delle membrane che avviene durante il cristae remodeling. Il mutante di BID nelle due Lisine (K 157, 158) conservate in questo dominio (BIDKKAA) è in grado di localizzarsi sui mitocondri così come la sua controparte wt ma è meno efficiente nel causare il rilascio di citocromo c. Con esperimenti di crosslinking abbiamo dimostrato che le suddette mutazioni nell’ elica 6 non impediscono l’oligomerizzazione di BAK ma riducono la capacità di BID di destabilizzare i complessi ad alto peso molecolare di OPA1. Il risultato è una diminuzione della percentuale di morte cellulare. Per questi motivi, abbiamo utilizzato questo mutante per studiare gli effetti del cristae remodeling sulla fisiologia mitocondriale. Abbiamo quindi osservato che BID wild-type (wt) diminuisce in maniera selettiva la respirazione mitocondriale dipendente dal complesso I la quale è strettamente influenzata dall’assemblaggio dei RCS. Dai risultati di Blue Native page ( BN PAGE) abbiamo confermato che BID agisce sui RCS bloccando l’assemblaggio dei singoli complessi della catena respiratoria nei RCS, senza interferire direttamente sulla struttura degli stessi complessi. Questi cambiamenti sono abrogati dal mutante di BID che non è in grado di provocare cristae remodeling ma sono mantenuti dai mutanti di BID che non attivano l’oligomerizzazione di BAX e BAK. Le basi molecolari che regolano la formazione e la stabilizzazione dei RCS sono a tutt’oggi sconosciuti. L’effetto selettivo del cristae remodeling sui RCS ha richiamato la nostra attenzione su OPA1, i cui oligomeri, bersaglio di BID durante l’apoptosi, sono importanti per il controllo della morfologia delle cristae . Per analizzare il ruolo di OPA1 nella formazione strutturale dei RCS, abbiamo utilizzato un approccio genetico e abbiamo analizzato la struttura e l’assemblaggio dei RCS nelle cellule Opa1-/-. Esperimenti di BN PAGE seguiti da BN seconda dimensione denaturante SDS-PAGE hanno rivelato che la struttura dei RCS, nelle cellule Opa1-/-, è fortemente compromessa. In particolare, grazie al saggio di assemblaggio dei supercomplessi (Acin-Perez et al., 2008) abbiamo dimostrato che il regolare schema di formazione dei RCS è perturbato nelle cellule Opa1-/- e ciò risulta in un’ anomala composizione di RCS. Da BN PAGE eseguiti con proteine codificate dal DNA mitocondriale (mtDNA) marcate con isotopi radioattivi, è emerso però che la quantità totale di proteine mitocondriali è minore nelle cellule Opa1-/- rispetto alle cellule wt poichè le cellule Opa1-/- hanno meno copie di mtDNA. Questa è una caratteristica in comune con le cellule Mfn 1-/-,2-/- che invece hanno una corretta biogenesi mitocondriale. Analizzando l’assemblaggio dei RCS nelle cellule Mfn 1-/-,2-/- abbiamo confermato che la loro struttura non è alterata. L’importanza fisiologica del mancato assemblaggio dei RCS è stata verificata testando la crescita delle cellule Opa1-/- quando obbligate ad utilizzare esclusivamente la respirazione mitocondriale. In queste condizioni la velocità di crescita delle cellule Opa1-/- è fortemente rallentata. Lo stesso fenomeno si verifica quando cellule mancanti BAX e BAK sono trasdotte con BID wt ma non quando trasdotte con il mutante KKAA il quale non causa cristae remodeling. In conclusione, i nostri dati confermano che la morfologia mitocondriale è essenziale per la corretta formazione dei RCS e sottolineano l’importanza di OPA1 come regolatore molecolare della struttura dei RCS. Inoltre i nostri risultati approfondiscono la conoscenza attuale del ruolo e degli effetti del cristae remodeling durante l’apoptosi, dimostrando che il cristae remodeling ha un importante effetto sull’efficienza respiratoria ed è fondamentale nell’induzione delle disfunzioni mitocondriali che si verificano durante l’apoptosi.