ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A PURE POPULATION OF ALDOSTERONE PRODUCING CELLS AS A NOVEL IN VITRO MODEL FOR THE STUDY OF THE ALDOSTERONE SECRETION

Primary aldosteronism (PA) is a common cause of secondary hypertension and is characterized by an excess “autonomous” secretion of aldosterone. In a percentage ranging from a half to two thirds of the cases it is due to a surgically curable aldosterone-producing adenoma (APA) and in the rest to bilateral adrenal hyperplasia. For both conditions the molecular mechanisms leading to aldosterone oversecretion are completely unknown. A major factor contributing to hindering investigation of these mechanisms entails the current unavailability of methods to isolate a pure population of normal adrenocortical zona glomerulosa (ZG) and APA cells. We have recently identified CD56 (Neural cell adhesion molecule, NCAM) as a cell specific membrane antigen of the normal human zona glomerulosa and medulla of the adrenal gland. By immunohistochemistry we detected intense CD56 immunostaining in the normal adrenal gland that was strictly confined to ZG and medulla; at contrary, zona fasciculata (ZF) was only weakly stained and labeling was totally absent in zona reticularis. The APA and pheochromocytoma cells, which are histogenetically derived from the ZG and the medulla, respectively, also showed intense CD56 immunostaining. Taken advantage of this unequivocal expression of CD56 we developed a novel cells isolating methodology based on CD56 immunobinding to magnetic beads. Human ZG and APA cells were obtained from adrenal gland and APA tissue after adrenalectomy and cells expressing CD56 antigen were selected by positive immunoseparation. We compared the morphology by light, phase and electron microscopy, and the function, by real-time polymerase chain reaction and radioimmunoassay of APA and ZG CD56-positive (CD56+) versus CD56-negative (CD56-) cells. Analysis of CD56 positive cells under light and phase contrast microscopy evidenced that these cells formed clumps, as the ZG cells; electron microscopy showed that they had multiple features typical of a steroidogenic phenotype ( such as mitochondria with tubulo-lamellar cristae, several lipid droplets, some lysosome, lipofucsin bodies). By immunocytochemistry CD56 antigen was detectable in all CD56+ cells examinated. No appreciable immunoreactivities to CD90 and Factor Von Willembrand were detected in CD56+ cells, at contrary in CD56- cells immunolabeling for CD90 and Factor Von Willembrand was stained. These results show that the mRNA expression of CD56 and CYP11B2 genes in CD56+ cells were markedly higher than CD56- cells (+1600% and 2100% increase, respectively). They also maintained an evident secretion of aldosterone in culture until day 6 (+1380% increase CD56+ cells versus CD56- cells). Hence, this study clearly indicates that CD56+ cells in culture maintained differentiated phenotype of ZG and APA cells supporting the conclusion that this novel technique is suitable for an accurate isolation of a pure aldosterone producing cells.

L’iperaldosteronismo primario (PA) colpisce l’11,2% degli ipertesi ed è quindi la più comune forma di ipertensione secondaria. E’ caratterizzato da un’ipersecrezione, apparentemente autonoma, di aldosterone da parte della zona glomerulosa (ZG) del surrene. Le principali cause di iperaldosteronismo primario sono l’adenoma aldosterone-secernente (APA) e l’iperplasia surrenalica bilaterale idiopatica (IHA). Nonostante l’alta prevalenza di questa causa di ipertensione arteriosa (IA) i meccanismi fisiopatologici e molecolari che portano allo sviluppo dell’APA e che determinano l’ipersecrezione dell’ aldosterone sono tuttora sconosciuti. Ciò dipende in larga misura dalla mancanza di modelli sperimentali ove investigare tali meccanismi. Questo studio ha permesso di identificare l’antigene di membrana CD56 come marker specifico delle cellule di APA e ZG. Colorazioni di immunoistochimica hanno mostrato che CD56 è abbondantemente espresso sia nella corteccia che nella midollare del surrene normale. Nella corteccia l’immunoreattività risulta intensamente positiva a livello della zona glomerulosa, mentre la zona fascicolata è solo debolmente positiva; CD56 risulta assente nella zona reticolare. Tutti gli APA esaminati esprimono alti livelli di CD56. In tutti i tipi di tessuto esaminati l’immunoreattività di CD56 è circoscritta alla membrana cellulare e in particolare a livello dei siti di contatto cellula-cellula. Scopo dello studio è stato quello di sviluppare un metodo per l’isolamento di una popolazione pura di cellule da APA e da ZG sfruttando la presenza di questo antigene. E’ stata, pertanto, sviluppata una metodica di immunoseparazione positiva per l’isolamento di questi tipi cellulari dal pool di cellule disperse ottenute in seguito a disgregazione del tessuto di partenza. Mediante immunoseparazione con biglie magnetiche precondizionate con anticorpo anti CD56 sono state ottenute 2 popolazioni cellulari: cellule CD56 negative (CD56-) e cellule CD56 positive (CD56+) legate alle biglie magnetiche. Le cellule CD56+, caratterizzate tramite microscopia elettronica immediatamente dopo immunoseparazione, mostrano mitocondri tipici di cellule di ZG con creste tubulo-lamellari, abbondante reticolo endoplasmatico liscio e la presenza di gocce lipidiche. In seguito a colorazione immunocitochimica le cellule CD56- risultano positive per CD90, antigene di superficie dei fibroblasti e per il Fattore di von Willembrand, antigene di superficie delle cellule endoteliali. Al contrario, la colorazione per il CD 90 e Fattore di von Willembrand risulta negativa nelle cellule CD56+. All’ analisi morfologica, le cellule CD56+, coltivate fino a 6 giorni su matrigel mostrano una morfologia di tipo epitelioide con nucleo prominente e gocce lipidiche sparse nel citoplasma. Inoltre, le cellule CD56+ mostrano un pattern di crescita caratterizzato dalla formazione di cluster sulla superficie di matrigel, mentre le cellule CD56- crescono in monostrato, caratteristica già descritta per le cellule di ZF e ZR. All’RT-RTPCR le cellule CD56+ sono caratterizzate da un’elevata espressione genica non solo di CD56 ma anche dell’aldosterone sintetasi (CYP11B2), enzima che catalizza la trasformazione di corticosterone in aldosterone, espresso esclusivamente nella zona glomerulosa surrenalica. Le cellule CD56+ mantengono sino al sesto giorno di coltura un’elevata produzione di aldosterone confermando la loro origine dalla ZG. La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio consente di isolare una popolazione pura di cellule aldosterone-secernenti che mantengono nel tempo le caratteristiche morfologiche e funzionali proprie di cellule di ZG e APA ed è pertanto dotata di alta specificità.