SINTESI E VALUTAZIONE BIOLOGICA DI NUOVI AGENTI POTENZIALMENTE UTILI NELLA TERAPIA DEL MELANOMA MALIGNO

Malignant melanoma is an extremely aggressive tumour, which originates from the neoplastic transformation of melanocytes. The therapy of metastatic melanoma, whose incidence is dramatically increasing, continues to be a challenge since, regardless of the treatment approach used (chemotherapy, immunotherapy or immuno-chemotherapy), a long-term survival is quite uncommon. In an attempt to improve the effectiveness of the anticancer drugs currently available and to decrease their systemic toxicity, in addition to exploit some biochemical characteristics rather specific of the melanoma cells, a useful approach might be also the use of prodrugs, targeted to the tumor cells, that would release the active drug directly into the tumor mass and/or their surrounding extracellular environment. Aim of my Ph.D. work was the synthesis and the biological evaluation of three types of new compounds, designed as possible agents useful in an anti-melanoma therapy. The first compound, which we synthesized and tested, was a peptide-paclitaxel conjugate containing three functional domains: a “targeting domain”, an “activation sequence” and the cytotoxic agent paclitaxel. The “targeting domain”, whose function was to direct the conjugate to the tumour mass, was represented by a cyclic peptide containing the RGD sequence that can bind selectively the αVβ3 integrin, a surface molecule overexpressed by both metastatic human melanoma cells and endothelial cells of tumour vessels. The “activation sequence”, which should allow a selective release of paclitaxel within the tumour mass, was represented by a short peptide, substrate of cathepsin B (a lysosomal and pericellular protease highly up-regulated in malignant tumours, including human melanomas). The third functional domain consisted of the anticancer drug paclitaxel. The second type of prodrug, which we designed and tested, was a 4-mercaptophenol derivative, containing a butenone moiety, the 4-[(4-hydroxyphenyl)sulfanyl]-3-buten-2-one, obtained in its E and Z geometric isomers. This compound has been designed considering that: a) the 4-mercaptophenol moiety would be a good substrate for tyrosinase, an enzyme expressed at high levels in melanoma cells, where it is involved in the biosynthesis of melanin, and able to oxidize a variety of natural and synthetic phenols, giving rise to alkylating and cytotoxic o-quinones; b) an α,β unsaturated side chain, reactive towards GSH (present in relatively high concentrations in melanoma cells) would decrease cellular antioxidant defense against the oxygen free radicals (ROS) generated as by-products during melanin synthesis, in normal as well in tumor cells. Therefore, our prodrug should act as a bifunctional agent, capable of generating cytotoxic o-quinone species (following its oxidation by tyrosinase) and reducing GSH levels. A third part of the present work has focused on the study of the naftoquinone alkannin and its two acetylated derivatives (1’-acetyl alkannin and 5,8,1’-triacetyl alkannin), as potential inhibitors of the human glutathione-S-transferase (GST) P1-1. This enzyme, which catalyzes the conjugation of GSH to a wide range of nucleophilic compounds, is expressed at high levels in many tumor cells, including melanoma cells, and is considered one of the factors responsible of tumor resistance towards anti-cancer agents. Therefore, a specific inhibitor of this enzyme could be useful in cancer therapy, making the tumor cells more sensitive to chemotherapeutic agents.

Il melanoma maligno è un tumore molto aggressivo, la cui incidenza è in costante aumento, che origina dalla trasformazione di cellule chiamate melanociti. La terapia del melanoma metastatico continua ad essere una difficile sfida, in quanto, indipendentemente dall’approccio terapeutico utilizzato (chemioterapia, immunoterapia o immuno-chemioterapia), i soggetti affetti raramente presentano una sopravvivenza a lungo termine. Per migliorare l'efficacia dei farmaci antitumorali attualmente disponibili e per diminuirne la tossicità sistemica, oltre a sfruttare alcune caratteristiche biochimiche relativamente specifiche delle cellule tumorali, e del melanoma in particolare, un approccio utile potrebbe anche essere quello di indirizzare verso le cellule tumorali dei profarmaci, che rilascino il farmaco attivo direttamente all’interno della massa tumorale e/o nel loro intorno extracellulare. I risultati riportati in questa tesi si riferiscono alla sintesi e alla valutazione biologica di tre nuovi tipi di composti progettati in questa ottica verso le cellule di melanoma. Il primo composto studiato è stato un coniugato peptidico del paclitaxel contenente tre domini funzionali: un dominio di "indirizzamento", una sequenza di "attivazione" e il paclitaxel, appunto, quale agente citotossico. Il dominio di “indirizzamento", la cui funzione era quella di dirigere il coniugato verso la massa tumorale, era rappresentato da un peptide ciclico contenente la sequenza RGD, in grado di legarsi selettivamente e con alta affinità all’integrina αVβ3, una molecola di superficie sovra-espressa sia dalle cellule di melanoma che dalle cellule endoteliali dei nuovi vasi tumorali. La sequenza di “attivazione ", che avrebbe dovuto consentire un rilascio selettivo del paclitaxel all’interno della massa tumorale, era rappresentata da una sequenza peptidica substrato della catepsina B, una proteasi a localizzazione lisosomiale e associata a membrana, altamente sovraespressa in molti tumori, compreso il melanoma. Il terzo dominio funzionale era costituito dal farmaco antitumorale vero e proprio, cioè dal paclitaxel, il cui legame con il peptide - nelle aspettative - avrebbe dovuto causarne la momentanea inattivazione fino al momento della sua effettiva liberazione in sede tumorale. Il secondo profarmaco testato è stato un derivato del 4-mercaptofenolo contenente una catena laterale butenonica, il 4-[(4-idrossifenil)sulfanil]-3-buten-2-one, ottenuto nei suoi due isomeri geometrici E e Z. Questo composto è stato progettato considerando che: a) la parte derivata dal 4-mercaptofenolo avrebbe dovuto essere un buon substrato per l’enzima tirosinasi (TYRase), un enzima espresso ad alti livelli nelle cellule di melanoma, perchè coinvolto nel processo di biosintesi della melanina, e in grado di ossidare una varietà di fenoli naturali e di sintesi, dando luogo a forme alchilanti e citotossiche come gli o-chinoni; b) la catena laterale butenonica (α,β insatura), essendo dotata di elevata reattività nei confronti del GSH, presente in concentrazioni relativamente elevate nelle cellule di melanoma, avrebbe dovuto sottrarre GSH alla cellula stessa, indebolendone di fatto le difese antiossidanti nei confronti dei radicali liberi dell’ossigeno (ROS) che si generano, come sottoprodotti, durante la sintesi di melanina sia in cellule normali che tumorali. Nelle aspettative, il profarmaco così progettato si sarebbe dovuto comportare come un agente bifunzionale in grado di formare o-chinoni citotossici in seguito alla sua ossidazione da parte della tirosinasi e in grado di ridurre al tempo stesso i livelli di GSH. Infine, un terzo approccio ha riguardato lo studio dell’alcannina (colorante naturale a struttura naftochinonica) e di due suoi derivati acetilati, quali possibili inibitori dell’enzima umano glutatione-S-transferasi (GST) di tipo P1-1, enzima espresso ad alti livelli in molti tumori tra cui appunto il melanoma. GSTP1-1 è un enzima coinvolto nel metabolismo di fase II degli xenobiotici, in quanto catalizza la coniugazione del GSH ad una vasta gamma di composti nucleofili, ma esso è anche ritenuto uno dei fattori promuoventi la farmaco-resistenza del tumore. Un inibitore specifico di questo enzima potrebbe essere quindi estremamente utile in una terapia antitumorale, rendendo le cellule tumorali più sensibili agli agenti chemioterapici.