MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERISATION OF INFLAMMATORY RESPONSES IN MILD TO SEVERE CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE (COPD): IDENTIFICATION OF AUTOIMMUNE STIGMATA

INTRODUCTION Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a major cause of illness and death throughout the world. A principal feature of COPD is a limitation of airflow that is not fully reversible and is associated with an abnormal inflammatory response in the small airways and alveoli. The principal abnormalities in small airways are the presence of an inflammatory cellular infiltrate and a tissue remodelling that thickens the airway wall, thereby reducing airway diameter and increasing resistance to flow. Moving beyond the original protease/anti-protease hypothesis, T-lymphocytes have been identified as a key component of the inflammatory response, thus introducing the concept that adaptive immunity may be centrally involved in the pathogenesis of the disease. A central role of the inflammatory response to inhaled particles and pollutants mediated by T cells seems to be crucial in the pathogenesis of COPD. Recently, an autoimmune origin has been proposed and different experimental and clinical studies are now focusing their attention on the complex immunological pathway at basis of the disease. AIM OF THE RESEARCH The main goal of the present research was a morphological and molecular characterisation of inflammatory responses in mild to severe COPD for the identification of tissue stigmata of autoimmunity. In particular, a precise morphological characterisation of inflammatory cell infiltration and the evaluation of proinflammatory mediators (interleukin-IL-32 and tumour necrosis factor-TNF-α) were performed in lung parenchyma of different COPD stages (GOLD I-IV). In a small number of COPD patients induced sputum was also analysed. All the morphological and molecular findings were correlated with clinical-functional data. MATERIAL AND METHODS The research was carried out in three phases. The first phase of the research involved the study of 40 end-stage COPD patients (including 9 patients with α1-antitrypsin deficiency). Control groups considered in the evaluations were represented by asymptomatic smokers with normal lung function (n=11) and non smokers (tissue samples from unused donor lungs for transplantation) (n=9). In all patients and controls the inflammatory cell infiltrate was characterised using immunohistochemistry for CD20, CD45RO, CD4, CD8, CD3 and CD68. In particular, aggregate of lymphomonocytes arranged as lymphoid follicles were counted on sections immunostained with anti-CD20. Manual tissue dissection of representative areas positive for CD20 (marker for B lymphocytes) was performed and DNA was extracted and analysed for immunoglobulin heavy chain (IgH) to assess the clonality of B lymphocytes. The second phase of the research included the lung tissue samples of 40 patients with different stages of COPD and the control groups described above. The expression of IL-32 and TNF-α was evaluated in all specimens using immunohistochemistry, confocal microscopy and polymerase chain reaction. The third phase of the research focused on immunocytochemical and molecular evaluation of IL-32 expression in induced sputum of 36 patients, 16 smokers with COPD, 14 smokers with normal lung function and 6 non-smokers. RESULTS First phase of the research: all the COPD samples showed severe emphysematous changes and inflammatory infiltrates. An increased number of inflammatory cells (CD20+, CD3+, CD8+, CD68+, CD45RO+, CD4+ cells and PMN), particularly of CD45RO, CD3 and CD8 positive cells, was detected in COPD patients. Lymphoid follicles were almost absent in normal lungs from donors but they frequently occurred in end-stage COPD and were mainly composed of B lymphocytes. In particular, lymphoid follicle number was increased in α1-antitripsin deficient patients as compared to COPD subjects. Molecular analysis of IgH showed a mono/oligoclonality of lymphoid follicles. Second phase of the research: the percentage of IL-32+ macrophages was higher in smokers with COPD compared to smoking and non-smoking controls. Moreover, an increased percentage of IL-32+ macrophages was detected in smokers with normal lung function when compared to non-smoking controls. Immunohistochemistry in serial sections and confocal microscopy confirmed the coexpression of IL-32 and TNF-α in the same cells. The greater proportion of IL-32 mRNA corresponded to IL-32 non-α (β, γ, δ and ε). IL-32α was seen in 54% of control cases (7/13) and in only 6% of patients with COPD (1/17). Third phase of the research: COPD patients showed a higher cell concentration in the induced sputum compared to smokers with normal lung function. In particular, COPD patients had decreased number of macrophages and increased neutrophils and lymphocytes. The IL-32 score and the pattern of IL-32 isoforms did not differ among the three groups: the amplicon corresponding to the β isoform was clearly visible in all cases, while the ε isoform was present in 54% of COPD patients, in 27% of control smokers and in 50% of non smokers. CONCLUSIONS Our major findings suggest that a significant and complex inflammation is involved in all the degrees and forms of the disease. Adaptive immune response, both T and B cells, consistently present in end-stage disease, is a key component in the progression of COPD. Interestingly, lymphoid follicles of B lymphocytes, showing an antigen specific induction with oligoclonal selection, as in other autoimmune diseases (e.g. Sjogren syndrome), were consistently present also in end-stage forms of COPD. The proinflammatory cytokines IL-32 and TNF-α were overexpressed in all stages and forms of COPD and were directly related to more severe inflammatory state, as occurs in other autoimmune diseases (e.g. rheumatoid arthritis). In conclusion, in our research study we found various tissue autoimmunity stigmata, which corroborate the new COPD pathogenetic hypothesis.

INTRODUZIONE La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una delle patologie responsabili del maggior numero di morti a livello mondiale. Clinicamente la BPCO si presenta come una limitazione del flusso respiratorio non completamente reversibile, associata ad una anomala risposta infiammatoria che caratterizza le piccole vie aeree e le strutture alveolari. A livello di tali distretti si riscontrano infatti un importante infiltrato cellulare infiammatorio e un rimodellamento architetturale che prevede un ispessimento delle pareti delle vie aeree periferiche, con conseguente riduzione del diametro e aumentata resistenza al flusso aereo. Inizialmente la patogenesi della BPCO si fondava sullo sbilanciamento del rapporto proteasi/antiproteasi, ma la visione attuale attribuisce un ruolo chiave alla risposta immunitaria acquisita, in particolare ai linfociti T. Infatti, la risposta infiammatoria mediata da tale tipo cellulare a gas e polveri inalati rappresenta un punto cruciale nello sviluppo della BPCO. Recentemente è stata ipotizzata un’origine autoimmune di tale patologia. Studi clinici e sperimentali si stanno focalizzando nello studio dei complessi meccanismi immunologici alla base della malattia. SCOPO DELLA RICERCA Il principale obiettivo di questa ricerca è stato quello di caratterizzare da un punto di vista morfologico e molecolare la risposta infiammatoria in pazienti con diversi gradi di BPCO (GOLD I-IV) al fine di identificare segni tissutali di autoimmunità. In particolare, nel parenchima polmonare di pazienti con diversi gradi di BPCO, è stato caratterizzato l’infiltrato cellulare infiammatorio ed è stata valutata l’espressione dei mediatori pro-infiammatori interleuchina-IL-32 e fattore di necrosi tumorale-TNF-α. In alcuni pazienti con BPCO è stato effettuato lo studio della cellularità e dell’espressione di IL-32 nell’espettorato indotto. Tutti i dati morfologici e molecolari sono stati correlati ai parametri clinici e funzionali. MATERIALI E METODI La ricerca è stata condotta fondamentalmente in tre fasi. La prima fase della ricerca ha previsto lo studio di 40 pazienti con BPCO in stadio IV, confrontandoli con i gruppi di controllo, costituiti da fumatori con funzionalità respiratoria normale (n=11) e non fumatori (i campioni tissutali sono stati ottenuti da polmoni non impiantati di donatori) (n=9). In tutti i pazienti e i controlli, l’infiltrato cellulare infiammatorio è stato caratterizzato mediante immunoistochimica per CD20, CD45RO, CD4, CD8, CD3 e CD68. In particolare, è stato valutato il numero di aggregati follicolari di linfomonociti in sezioni dopo immunoistochimica per CD20, essendo tali follicoli prevalentemente costituiti da linfociti B. Dopo dissezione manuale di follicoli CD20 positivi, è stato estratto il DNA ed è stata valutata la clonalità della popolazione linfocitaria di tipo B mediante analisi della catena pesante delle immunoglobuline (IgH). La seconda fase della ricerca è stata condotta nei campioni tissutali di 40 pazienti con diversi stadi di BPCO e nei gruppi di controllo descritti precedentemente. In particolare, è stata valutata l’espressione di IL-32 and TNF-α mediante immunoistochimica, microscopia confocale e reazione a catena della polimerasi. Nella terza fase della ricerca ci si è focalizzati sullo studio immunocitochimico e molecolare dell’espressione di IL-32 nell’espettorato indotto di 36 pazienti, 16 fumatori con diagnosi di BPCO, 14 fumatori con funzionalità respiratoria normale e 6 non fumatori. RISULTATI Prima fase della ricerca: tutti i campioni tissutali di pazienti con BPCO presentavano estese alterazioni enfisematose ed un importante infiltrato infiammatorio. E’ stato riscontrato un aumentato numero di cellule infiammatorie (CD20+, CD3+, CD8+, CD68+, CD45RO+, CD4+), soprattutto di cellule CD45RO, CD3 e CD8 positive, nei pazienti con BPCO rispetto ai soggetti di controllo. I follicoli linfoidi erano quasi assenti nei polmoni senza alterazioni istologiche di rilievo dei donatori ma sono stati frequentemente riscontrati nei BPCO molto gravi (stadio IV). I linfociti B (cellule CD20 positive) erano il principale tipo cellulare presente in tali follicoli. In particolare, il numero di follicoli linfoidi risultava aumentato nei pazienti con BPCO da deficit di α1-antitripsina rispetto ai pazienti senza deficit. L’analisi molecolare delle IgH ha mostrato un’origine mono/oligoclonale di tali follicoli. Seconda fase della ricerca: è emerso un aumento della percentuale di macrofagi IL-32 positivi nei pazienti con BPCO rispetto ai controlli fumatori e non fumatori. Inoltre, tale percentuale risultava aumentata nei fumatori con funzionalità respiratoria normale rispetto ai non fumatori. Le indagini immunoistochimica e di microscopia confocale hanno dimostrato una coespressione di IL-32 e TNF-α. La reazione a catena della polimerasi ha confermato i dati immunoistochimici e mostrato che l’mRNA di IL-32 corrispondeva alle isoforme non-α (β, γ, δ e ε). L’isoforma α è stata riscontrata nel 54% dei soggetti di controllo (7/13) e solo nel 6% dei pazienti con BPCO (1/17). Terza fase della ricerca: si è notata una maggiore cellularità totale nell’espettorato indotto dei pazienti con BPCO rispetto ai gruppi di controllo. In particolare, i pazienti con BPCO presentavano un minor numero di macrofagi e un aumentato numero di neutrofili e linfociti. L’espressione di IL-32 e il tipo di isoforme rilevate non sono risultati differenti nei tre gruppi: l’amplificato corrispondente all’isoforma β era visibile in tutti i casi, mentre l’isoforma ε nel 54% dei pazienti con BPCO, nel 27% dei fumatori di controllo e nel 50% dei non fumatori. CONCLUSIONI I nostri principali risultati confermano il ruolo chiave della risposta immunitaria nella patogenesi della BPCO, in quanto preponderante in ogni stadio e forma della patologia. La risposta immunitaria acquisita, costituita da linfociti T e B, è una componente chiave nella progressione della malattia, vista la persistenza anche nelle forme end-stage di BPCO. Di particolare interesse è stato il riscontro di linfociti B aggregati in follicoli linfoidi nella BPCO, risultanti da un processo di selezione oligoclonale come occorre in altre malattie autoimmuni (es. sindrome di Sjogren). Le citochine proinfiammatorie IL-32 e TNF-α sono risultate notevolmente espressi in tutti gli stadi e forme della BPCO e correlavano direttamente con la severità del grado di infiammazione, così come è stato riscontrato in altre patologie autoimmuni (es. artrite reumatoide). In conclusione, nel nostro studio sono state riscontrati segni tissutali di autoimmunità, che corroborano la nuova ipotesi patogenetica della BPCO.