IL CONDENSATO DELL'ARIA ESPIRATA NELLO STUDIO DI PATOLOGIE RESPIRATORIE PEDIATRICHE

Background and aims. In the field of pediatric pulmonology, in the past 10 years there has been a growing interest toward the study of the airway inflammation by means of non-invasive techniques. In fact, although bronchoscopy with bronchoalveolar lavage and bronchial biopsies still represents the gold standard technique for the study of the lung, its invasiveness prevents a diffuse use, particularly when working with children. Non-invasive techniques have therefore been developed, the most studied of which is the measurement of the exhaled nitric oxide (FENO), a marker of eosinophilic inflammation. A second promising non-invasive technique is represented by the analysis of exhaled breath condesate (EBC). This is a biofluid collected by cooling the exhaled air, the composition of which is believed to reflect that of airway lining fluid. The main advantage of this technique is that it allows the study of a wide range of biomarkers, enabling the study of different pathogenetic pathways in different respiratory diseases. Recently, beside the measure of single biomarkers of disease, a new approach for the analysis of EBC has been proposed: the metabolomic approach. The metabolomic analysis is based on spectroscopic techniques (usually NMR-spectroscopy and mass spectrometry) combined with a multivariate statistical analysis, and it leads to the identification of metabolite profiles that characterize groups of subjects, enabling the discrimination between healthy and ill subjects or between subjects with different disease phenotypes. Aim of the present research project, which has been developed through 3 different studies, was the application of the EBC technique in the study of pediatric respiratory diseases. Methods and Results. 1) In the first study (Exhaled leukotriene B4 in children with community acquired pneumonia) the EBC was applied for the first time in the evaluation of children with community acquired pneumonia. Leukotriene B4 (LTB4), a strong chemotactic agent for activated neutrophils, has been measured in the EBC of 18 children with CAP. LTB4 concentration was higher in the EBC of these children than in the EBC of 17 healthy controls and normalized after one week of antibiotic therapy. The study demonstrated that by means of the EBC technique it is possible to non-invasively monitor a marker of the lung`s biological response to infections in children. The study has been published in Pediatric Pulmonology (Carraro S, et al. Exhaled leukotriene B4 in children with community acquired pneumonia. Pediatr Pulmonol. 2008;43:982-6). 2) In the second study (EIA and GC-MS analysis of 8-isoprostane in EBC of children with problematic asthma) we evaluated 8-isoprostanein the EBC of children with well-controlled and problematic asthma, finding increased levels of this biomarker of oxidative stress in the problematic asthma group. This finding paves the way to the development of new therapies - targeted at the control of oxidative stress - which could improve the management of problematic asthma. This study had also a methodological objective: the comparison between the measurements of 8-isoprostane in EBC performed by enzymatic immunoassay and those performed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), a reference analytical technique. We found an acceptable reproducibility between the two methods, but the latter had higher accuracy. The study has been published in the European Repiratory Journal (Carraro S, et al. EIA and GC-MS analysis of 8-isoprostane in EBC of children with problematic asthma. Eur Respir J. 2009 Nov 6. [Epub ahead of print] doi:10.1183/09031936.00074909) 3) In the third study (Metabolomic analysis of breath condensate in the characterization of asthma phenotypes in children) the metabolomic analysis of EBC was applied to characterize from a metabolic standpoint different asthma phenotypes. Because of its non-selective nature, the metabolomic analysis considers a great number of metabolites and can identify clusters of bimolecules involved in the characterization of specific groups of patients. We found that the metabolomic analysis enables a clear discrimination between children with mild asthma (either regularly treated with inhaled steroids or steroid naive) and children with severe asthma. In the characterization of children with mild asthma a metabolite emerged as important, belonging to the family of prostanoids. In severe asthma, although no single variables were identified, there was an overall metabolic fingerprint that clearly characterizes this group. These results suggest that a different biochemical-inflammatory profile underlies these two asthma phenotypes. Further study could confirm the role of the EBC metabolic profile in the early characterization of asthma phenotype in children. Conclusions In conclusion the research project demonstrated EBC can be applied with success in different respiratory diseases of childhood, both acute, as CAP, and chronic, as asthma. The study on 8-isoprostane also provides important methodological information inasmuch as it demonstrates an acceptable reproducibility between the immunoenzymatic method (which is the most commonly used) and the reference analytical method GC-MS, though the latter is more accurate. Eventually the metabolomic study represents a step forward the characterization of different asthma sub-phenotypes from a biochemical-inflammatory standpoint and it paves the way to further studies applying this innovative approach.

Background e obiettivi. Negli ultimi 10 anni, nel campo della pneumologia pediatrica, c'è stato un crescente interesse verso lo sviluppo di metodiche non invasive per lo studio dell infiammazione delle vie aeree. Infatti, sebbene la metodica gold standard sia rappresentata dalla broncoscopia con il broncolavaggio e le biopsie bronchiali, l'invasività di tale procedura ne limita l'uso a selezionate indicazioni cliniche non permettendo l'applicazione ad un'ampia popolazione, in particolare nell'ambito pediatrico. Sono state pertanto sviluppate metodiche non invasive tra le quali la più studiata è la misura dell'ossido nitrico nell'aria esalata (FENO), marker di infiammazione eosinofilica delle vie aeree. Altra promettente metodica non invasiva è rappresentata dall'analisi del condensato dell'aria espirata (EBC). Il condensato è un biofluido ottenuto mediante il raffreddamento dell'aria espirata. La composizione di tale biofluido rispecchia le caratteristiche del liquido di superficie delle vie aeree. Caratteristica fondamentale del condensato è che permette il dosaggio di diversi biomarkers, consentendo di indagare sui vari processi patogenetici coinvolti nelle malattie respiratorie. Recentemente, accanto alla possibilità di dosare singoli mediatori, è stata proposta la possibilità di analizzare il condensato mediante un approccio innovativo: l'analisi metabolomica. Questa biotecnologia si basa sull'applicazione di tecniche spettroscopiche (generalmente la spettroscopia basata sulla RNM e la spettrometria di massa) combinate con un'analisi statistica multivariata e permette di identificare profili metabolici caratteristici di un gruppo di soggetti, consentendo quindi la discriminazione sia tra sani e malati che tra soggetti con diversi fenotipi di malattia. Obbiettivo del presente progetto di ricerca, sviluppato attraverso 3 studi distinti, è stato l'applicazione della metodica non invasiva del condensato dell'EBC nello studio di patologie respiratorie di interesse pediatrico. Metodi e Risultati 1) Nel primo studio (Exhaled leukotriene B4 in children with community acquired pneumonia) l'EBC è stato utilizzato per la prima volta nella valutazione di bambini con polmonite acquisita in comunità (CAP). Il leucotriene B4 (LTB4), un potente agente chemiotattico dei neutrofili attivati, è stato dosato nell'EBC di 18 bambini con CAP. La concentrazione dell'LTB4 era aumentata in questi bambini rispetto a 17 controlli sani ed andava incontro a normalizzazione dopo una settimana di terapia antibiotica. Lo studio ha dimostrato che mediante la metodica dell'EBC è possibile monitorare in modo non invasivo l'andamento di un marcatore della risposta biologica del polmone alle infezioni respiratorie nei bambini. Lo studio è stato pubblicato sulla rivista Pediatric Pulmonology (Carraro S, et al. Exhaled leukotriene B4 in children with community acquired pneumonia. Pediatr Pulmonol. 2008;43:982-6). 2) Nel secondo studio (EIA and GC-MS analysis of 8-isoprostane in EBC of children with problematic asthma) abbiamo valutato l'8-isoprostano nell'EBC di bambini con asma ben controllato e con asma problematico, dimostrando concentrazioni più elevate di questo marker di stress ossidativo nei bambini con asma problematico. Tale dato apre la strada allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, mirate al controllo dello stress ossidativo, che potrebbero migliorare la gestione dell'asma problematico. Questo studio comprendeva anche una parte metodologica che consisteva nel confronto del dosaggio dell'8-isoprostano effettuato con metodica immunoenzimatica, che costituisce la tecnica più frequentemente utilizzata negli studi, e con gas comatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS), che rappresenta una metodica analitica di riferimento. Le due metodiche di analisi hanno dimostrato una riproducibilità accettabile, sebbene la CG-MS sia caratterizzata da maggiore accuratezza. Lo studio è stato pubblicato sulla rivista European Repiratory Journal (Carraro S, et al. EIA and GC-MS analysis of 8-isoprostane in EBC of children with problematic asthma. Eur Respir J. 2009 Nov 6. [Epub ahead of print] doi:10.1183/09031936.00074909) 3) Il terzo studio (Metabolomic analysis of breath condensate in the characterization of asthma phenotypes in children) si è basato sull'applicazione dell'analisi metabolomica all'EBC per caratterizzare dal punto di vista metabolico diversi fenotipi di asma. L'analisi metabolomica, grazie alla sua natura non selettiva, permette il dosaggio contemporaneo di un numero molto elevato di metaboliti consentendo di individuare cluster di biomolecole coinvolte nella caratterizzazione di specifici gruppi di pazienti. Abbiamo dimostrato che l'analisi metabolomica è in grado di discriminare nettamente i bambini con asma lieve (trattati o meno con steroidi inalatori) da quelli con asma severo, suggerendo che un diverso profilo biochimico-infiammatorio sottende questi 2 fenotipi di asma. Nella caratterizzazione dei bambini con asma lieve, in particolare, è emersa come importante una variabile che identifica un metabolita appartenente alla famiglia dei prostanoidi. Per i bambini con asma severo, pur non essendo stata identificata una singola variabile caratterizzante, è emerso un profilo metabolico che nel suo insieme li distingue nettamente dagli altri gruppi. Studi ulteriori potrebbero confermare il ruolo di tali profili metabolici dell'EBC nella caratterizzazione precoce del fenotipo asmatico nei bambini. Conclusioni Il presente progetto di ricerca dimostra nel suo complesso che la metodica del condensato dell'aria espirata può essere applicata con successo in diverse malattie respiratorie pediatriche sia acute, quali la polmonite, che croniche, quali l'asma. Lo studio dell'8-isoprostano fornisce inoltre interessanti elementi metodologici, dimostrando una accettabile riproducibilità  tra la metodica immunoenzimatica e la GC-MS, sebbene quest'ultima abbia una maggiore accuratezza. Infine lo studio metabolomico rappresenta un significativo passo avanti nella caratterizzazione dei fenotipi di asma da un punto di vista biochimico-infiammatorio e apre la strada a nuovi studi che sfruttino questo approccio innovativo.