Structure and interactions of the STAS domains and of the Myb/SANT domains by means of NMR techniques

The present work is divided in two parts: the first one concerns the STAS domains, while the second one the Myb/SANT domains. The guiding thread linking the two parts is constituted by the method and the aims: these are the study of the structure and of the interactions of these domains by means of NMR techniques. The first family, the STAS (Sulfate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist) was originally discovered by similarity with the ASA (Anti Sigma factor Antagonist), bacterial domains contained in proteins involved in the environmental stress response and in the induction of sporulation. The STAS are present in plants, bacteria, fungi and animals, in proteins with different roles, like light/oxygen/cyclic nucleotides sensors, transporters of various kinds, etc… They present a structure with five β-sheets and four α-helices, interspersed in a irregular way. The STAS structures from transporters currently known (Protein Data Bank, January 2013) are currently five: four bacterial one, one of mammal, none vegetal. The only mammalian structure known corresponds to the STAS of prestin from Rattus norvegicus, missing the Intervening Sequence (IVS), a sequence largely variable among the same family of proteins: one of the aims was achieving the full domain. The aforementioned prestin belongs to the SLC26A family, transmembrane anion transporters with a role in maintaining the electrolytic balance in epithelia. However, prestin is an anomalous member of this family, since it does not work as a transporter but as the motor protein responsible of the cochlear sound amplification. Besides the interest in the study of the full STAS domain, the attention was focused also on possible interaction partner. One of them, based on the activity model of an ammonium transporter where its C-terminal domain interacts with a cytoplasmic loop, could have been the so called Saier motif, constituted by a repeated amino acid triplet with a certain degree of conservation. The construct for the Saier motif was modelled on structural data available for the bacterial transporter BicA, a model that demonstrated to be not applicable to prestin, since this construct, cloned and expressed, had severe problems of solubility during the purification, already as a fusion protein. The STAS domain were most of the efforts were focused on was the one belonging to the sulfate transporter SULTR1;2 from Arabidopsis thaliana. This domain presents a 10 amino acid intervening sequence and no STAS structures from plants are currently known. After a trial with a construct already available, five new ones were cloned and tested. Anyway, it has not been possible obtaining a NMR sample but the most promising construct has been chosen for further attempts to optimize the final NMR buffer. The second part of this thesis, carried out at the Structural Genomics Consortium (SGC) in Toronto, Canada, deals with the Myb/SANT domains. These 50 amino acid domains present a three helix structure, where the second and the third helix (the most C-terminal ones) constitute a Helix-Turn-Helix (HTH) motif. Additional elements, such as further helices or β-hairpins, could be present. The difference of this domains stays in the distribution of the superficial charge: positive on the third helix and negative on first one for the Myb, the opposite for the SANT. The Myb are known chiefly as DNA-binding domains with their third helix, even if new evidence support that the first helix can interact with the basic histone tails; the SANT instead bind the histone tails with their third helix. Two domains of this family were solved and presented in this work: the repeat R1 of the DNA-binding domain of hDmp1 and the SANT2 domain of NCoR2. hDmp1 is a tumour suppressor protein with a DNA-binding domain constituted by three imperfect repeats: the structure of the most N-terminal repeat, R1, was solved, which showed the typical three helix structure and the same electrostatic surface properties of the Myb domains. Anyway, this portion of the domain does not bind DNA, tested with known and new sequences. This result is in agreement with what is known about DNA-binding domains of similar structure, where the interaction with DNA concerns only the R2 and R3 repeat, while R1 seems to have a secondary function. The other domain solved is the SANT2 of the protein NCoR2, a protein acting as nuclear receptor repressor in the absence of ligand. This protein has two SANT domains: the structure of the most N-terminal one was already solved (PDB. 1XC5) and studied, in particular as interaction partner of the enzyme histone deacetylase 3 (HDAC3). Nevertheless, the SANT2 domain has shown particular properties: besides a long additional helix at the C-terminal and a region of conformational averaging between these helix and the previous one, it presents electrostatic surface properties typical of the Myb, not of the SANT domains. No DNA interactions are known, but with the H4 histone tails, used for binding experiments monitored by 15N-HSQC. However, the concerned region lies in proximity of a mutation that was detected in the NMR sample during the assignment: the production of the wild-type protein and the repetition of the binding experiments have been planned.

Il presente lavoro è stato suddiviso in due parti: la prima concernente i domini STAS, mentre la seconda i domini Myb/SANT. Il fil rouge che unisce le due parti è costituito dalla metodica e dagli scopi, ovvero lo studio della struttura e delle interazioni di questi domini tramite NMR in soluzione. La prima famiglia di domini trattati, gli STAS (Sulphate Transporter and Anti Sigma factor antagonist), è stata originariamente classificata sulla base della similarità con gli ASA (Anti Sigma factor Antagonist), domini batterici contenuti in proteine coinvolte in risposte contro gli stress ambientali e nell’induzione della sporulazione. Gli STAS sono presenti in piante, batteri, funghi e animali, in proteine con i ruoli più diversi, come sensori di luce, ossigeno, nucleotidi ciclici, trasportatori vari, ecc... Presentano una struttura con cinque β-sheets e quattro α-eliche, intercalati in maniera irregolare. Le strutture di domini STAS di trasportatori attualmente note (Protein Data Bank, Gennaio 2013) sono cinque: quattro batteriche, una di mammifero, nessuna di vegetale. L’unica struttura nota di mammifero corrisponde allo STAS di prestina di Rattus norvegicus, mancante della Intervening Sequence (IVS), una sequenza variabile da proteina a proteina della stessa famiglia: uno degli obiettivi consisteva nell’ottenere questo dominio completo. La succitata prestina fa parte della famiglia degli SLC26A, trasportatori anionici transmembrana con un ruolo nel mantenimento dell’equilibrio elettrolitico a livello degli epiteli. Prestina però è un membro anomalo di questa famiglia, in quanto, nei mammiferi, non funziona da trasportatore bensì da proteina motore nell’amplificazione cocleare del suono. Oltre all’interesse per lo studio del suo dominio completo dello STAS di prestina, l’attenzione è stata focalizzata anche su possibili partner di interazione. Uno di essi, ipotizzato sulla base sul modello di attivita di un trasportatore di ammonio in cui un dominio C-terminale interagisce con un loop citoplasmatico, poteva essere il cosiddetto motivo di Saier, costituito da una tripletta di amino acidi ripetuta abbastanza conservata. Il costrutto del motivo di Saier è stato modellato sui dati strutturali ottenuti sul trasportatore batterico BicA, un modello che si è dimostrato non applicabile per prestina, in quanto il costrutto, una volta clonato ed espresso, ha mostrato gravi problemi di solubilità in fase di purificazione, già a livello di proteina di fusione. Il dominio STAS su cui sono stati concentrati i maggiori sforzi è quello appartenente al trasportatore di solfato SULTR1;2 di Arabidopsis thaliana. Questo proteina presenta una intervening sequence di soli 10 aminoacidi e attualmente non sono note strutture di STAS vegetali. Dopo una prova preliminare con un costrutto del dominio già disponibile in laboratorio, ne sono stati clonati e testati altri cinque che differivano tra loro nella lunghezza della prozione N-terminale della sequenza.. Non è stato tuttavia possibile ottenere un campione adatto per studi NMR ma è stato scelto il costrutto più promettente per ottimizzazione del tampone finale, sul quale nuovi tentativi sono in programma. La seconda parte del progetto, svolta presso lo Structural Genomics Consortium (SGC) di Toronto, Canada, ha riguardato i domini Myb/SANT. Questi domini di circa 50 amino acidi presentano entrambi una struttura con tre eliche, dove la seconda e la terza elica (quelle più C-terminali) costituiscono un motivo Helix-Turn-Helix (HTH). Elementi addizionali, come ulteriori eliche o β-hairpins, possono essere presenti. Ciò che li differenzia è la distribuzione della carica superficiale: positiva sulla terza elica e negativa sulla prima elica per i Myb, invertita per i SANT. I Myb sono noti principalmente come domini che legano il DNA con la loro terza elica, anche se nuove evidenze dimostrano che la prima elica può interagire con le code basiche degli istoni; i SANT invece legano le code degli istoni con la terza elica. Le strutture di due domini di questa famiglia sono stati risolti e presentati in questo lavoro: la ripetizione R1 del DNA-binding domain della proteina hDmp1 e il dominio SANT2 di NCoR2. hDmp1 è un oncosoppressore che contiene un DNA-binding domain costituito da tre ripetizioni imperfette: è stata risolta la struttura della ripetizione più N-terminale, R1, che ha dimostrato la tipica struttura a tre eliche dei Myb e le stesse proprietà elettrostatiche di superficie. Tuttavia, questa porzione del dominio non si lega al DNA, di cui sono state testate sequenze note e altre nuove. Questo è in accordo con quanto è già noto sui DNA-binding domain di struttura simile, dove l’interazione con il DNA riguarda solo le ripetizioni R2 e R3, mentre R1 sembra avere una funzione accessoria. L’altro dominio risolto è il SANT2 di NCoR2, una proteina che agisce da repressore dei recettori nucleari in assenza di ligando. Questa proteina possiede due domini SANT: la struttura di quello situato nell’estremità più N-terminale è già stata risolta (PDB: 1XC5) e studiata, in particolare come partner di interazione dell’enzima istone deacetilasi 3 (HDAC3). Il dominio SANT2 ha dimostrato però proprietà peculiari e differenti dai SANT: oltre ad avere una lunga elica addizionale all’estremità C-terminale e una zona di conformational averaging tra questa elica e quella precedente, presenta proprietà elettrostatiche di superficie tipiche dei Myb, non dei SANT. Non sono note interazioni con il DNA, ma con le code istoniche dell’istone H4, con cui sono stati fatti degli esperimenti di binding monitorati tramite 15N-HSQC. La regione interessata da questo legame però confina con una mutazione che è stata rilevata nel campione NMR in fase di assegnazione: è quindi in programma la produzione della proteina wild-type e la ripetizione degli esperimenti con le code di H4.