Novel molecular strategies to overcome creb overexpression in acute myeloid leukemia

Leukemias are the most common form of pediatric cancers, and whereas Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) treatment has made significant progresses over the past decades reaching up to 86% of survival, Acute Myeloid Leukemia (AML) survival rate reaches the 60%, and 30% of those patients relapsed within 1/2 years from remission. The cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responsive element binding protein (CREB) has been found to be overexpressed in the leukemic blast cells of 66% of patients with AML and in the 84% of patients with ALL, compared to normal bone marrow or remission samples. CREB overexpression in AML patients was also correlated with a worse prognosis and increased risk of relapse. Nevertheless, CREB’s role in AML pathogenesis is still debated. In this work I identified three main ways in order to target CREB overexpression: ICER, its endogenous repressor; the miR-34b which targets its 3’UTR; the zebrafish as an in vivo model where new molecules can be tested. CREB level has been shown to be controlled by the inducible cAMP early repressor (ICER), an endogenous CREB competitor able to recognize cAMP responsive element (CRE) sequences and stop transcriptional activity. ICER level was found downregulated in AML, failing to control CREB transcriptional activity, thus sustaining leukemia. Restoration of ICER expression in leukemic cell lines and in AML primary cultures, led to a decreased expression of CREB and its target genes. Among the genes affected by ICER restoration, impairment of the dual-specificity phosphatases DUSP1 and DUSP4 was found. The decreased level of DUSPs1/4 directly sustained the p38-mediated apoptotic pathway, which in turn triggered caspase-dependent apoptosis. This important ICER role in cell death, led us to focus the attention on combining its action together with specific drug treatment. AML cell lines reduced cell growth and enhanced apoptotic behavior after chemotherapy treatment if ICER was expressed. A significant lowered expression of CREB target genes involved in cell cycle control (CyA1, B1, D1), and in mitogen-activated protein kinase signaling pathway (ERK, AKT, DUSP1/4) was found after Etoposide (a topoisomerase inhibitor used in therapy of AML) treatment. To verify the involvement of DUSPs on p38 activation, we silenced DUSPs1/4 in HL60 cell lines, and we confirmed the same enhanced drug sensitivity induced by ICER. Moreover, DUSPs1/4 silencing or ICER restoration in primary AML cultures showed DUSP1 downregulation and p38 activation. ICER has been demonstrated to mediate chemotherapy activity by DUSP1-p38 pathway activation, thus reprogramming leukemic cells from survival to apoptosis. These results supported important effects of ICER restoration which mediated CREB activity, remarking the involvement of CREB in sustaining leukemia. Thus we argued to seek out the cause of CREB overexpression in AML, and giving that it was found overexpressed in its proteic form, we looked at translational control, focusing on microRNAs. We found that miR-34b targeted the 3’UTR of CREB gene, and was downregulated in AML. We dissected its role in inducing CREB overexpression. We used AML cell lines and revealed the hypermethylation of its promoter. Thus, we analyzed miR-34b expression and methylation status of its promoter in cells from patients diagnosed with myeloid malignancies. We found that miR-34b was upregulated, since it was not hypermethylated at its promoter, in pediatric patients affected by preleukemic hematopoietic disease as juvenile myelomonocytic leukemia (JMML, n=17) and myelodysplastic syndrome (MDS n=28) with the concomitant low CREB expression. On the other hand, miR-34b was downregulated in AML patients at diagnosis (n=112). Our results showed that hypermethylation of the miR-34b promoter occurred in 66% of acute myeloid leukemia, explaining the low miR-34b levels and CREB overexpression, whereas preleukemic MDS and JMML patients were not associated with hypermethylation nor CREB overexpression. Interestingly, in paired samples of MDS evolved into AML, we confirmed miR-34b promoter hypermethylation at leukemia onset, and gene expression profile revealed 103 CREB target genes differentially expressed between the two disease stages. This subset of CREB targets was confirmed to associate with high risk MDS in a separate cohort of patients (n=20), identifying a signature of myeloid transformation To confirm this hypothesis, we evaluated miR-34b tumor suppressor potential in vitro and in vivo, finding that miR-34b restoration decreased AML engraftment and progression through CREB-dependent pathways. These results confirmed that miR-34b controlled CREB expression and contributed to myeloid transformation. Furthermore, we identified a subset of CREB target genes that represents a novel transcriptional network involved in tumor formation, and their functional activity may be further pursued. We considered to test CREB and its target genes’ role in mediating MDS and AML in a suitable in vivo model, such as zebrafish. We chose this model organism for its numerous advantages that led to its widespread use in both developmental studies and cancer research, such as high regenerative ability, rapid and transparent embryonic development, and easy genetic manipulation. We integrated a plasmid coding human CREB under pu.1 promoter into fertilized egg at one cell stage to overexpress CREB in the myeloid lineage. Results showed that CREB-overexpression led to hematopoiesis perturbation in embryos at 24 and 48 hours post fertilization, with an altered CREB target gene expression, that conferred an enhanced cell cycle progression. Since 6 months after CREB enforced expression, zebrafish kidney marrow showed dysmyelopoiesis, with increased monocytes and myelocytes rates. At the age of 9 months, CREB-overexpressing zebrafish developed a sick phenotype with abdominal and dorsal enlargement that at morphological evaluation resembled an abdominal mass formed by clonal cells with infiltrating capability. The mass cells were found to originate from the cells overexpressing human CREB, to rapidly proliferate and to migrate into gills, adipose tissue and muscles. Mass cell morphology was similar to that of kidney marrow with a complete lack of myelocytes, and a preponderance of monocytes, confirming a myeloproliferative disease. These results demonstrated that zebrafish overexpressing CREB resembled the same dysmyelopoiesis already seen in vitro and in CREB transgenic mice, with a relevant perturbed CREB target gene expression. The long latency of disease onset suggested that additional events may occur. Neverthless, CREB-overexpressing zebrafish model recapitulated a CREB-mediated myeloproliferative disease: it represents a useful model with high potentialities in dissecting CREB role on malignant transformation. Moreover, the use of ICER and miR-34b as tumor suppressors, as well as the screen of novel compounds which may be confidently tested, will open for further therapeutic opportunities.

La leucemia è il cancro più diffuso nell’età pediatrica. Oggigiorno, le cure per la Leucemia Linfoide Acuta (LAL) hanno portato a progressi molto significativi, con una sopravvivenza dei pazienti che raggiunge l’86%, mentre il trattamento contro la Leucemia Mieloide Acuta (LAM) ha raggiunto una quota di sopravvivenza del 60%, ma entro 1/2 anni dalla remissione il 30% di questi ultimi ricade. Uno dei principali scopi della ricerca nelle LAM è quello di identificare nuovi marcatori molecolari che siano in grado di identificare geneticamente alcuni sottogruppi di LAM, e anche di comprendere la leucemogenesi. A questo scopo, negli ultimi anni è stato identificato il gene CREB (cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responsive element binding protein), che codifica per un fattore di trascrizione implicato nelle principali attività cellulari. Nel 66% dei pazienti affetti da LAM, e nell’84% dei pazienti affetti da LAL, è stata trovata una sovra espressione della proteina CREB rispetto alla espressione fisiologica dello stesso riscontrata in cellule di midollo osseo di donatori sani o di pazienti in remissione. Inoltre è stata trovata una correlazione tra la sovra espressione di CREB nelle LAM, ed una prognosi peggiore con un aumentato rischio di ricaduta. Ciononostante, il ruolo di CREB nella patogenesi delle LAM rimane ancora dibattuto. In questo lavoro, ho utilizzato tre diverse strade per agire sulla sovra espressione di CREB: ICER, il suo repressore endogeno; miR-34b, microRNA che si lega alla sua regione 3’UTR; lo zebrafish, come modello in vivo per poter testare nuove molecole. In lavori precedenti è stato dimostrato che l’espressione di CREB è controllata dalla presenza di ICER (inducible cAMP early repressor), un inibitore endogeno di CREB. ICER infatti compete con CREB per legare le sequenza responsive CRE che si trovano nel promotore dei geni target, e blocca l’attività trascrizionale. Il livello di ICER è stato trovato sotto espresso nelle LAM, con una conseguente perdita di inibizione sull’attività trascrizionale di CREB, promuovendo così l’avanzare della leucemia. In questo lavoro siamo andati a studiare il ruolo di ICER introducendolo in forma esogena nelle linee cellulari leucemiche e nelle culture primarie di LAM. La riespressione di ICER portava ad una diminuzione dell’espressione di CREB e dei suoi geni target. Tra questi ultimi, in particolare, era stata trovata una diminuzione dell’espressione di DUSP1 e DUSP4 (dual-specificity phosphatases). Abbiamo verificato che la riduzione delle DUSPs1/4 andava ad attivare direttamente p38, che a sua volta induceva l’apoptosi caspasi-dipendente. Dato il coinvolgimento di ICER nella morte cellulare, abbiamo cercato di combinare la sua azione al trattamento farmacologico chemioterapico. Nel trattamento delle linee cellulari leucemiche, questa combinazione ha portato ad una riduzione della crescita cellulare e ad un aumento dell’apoptosi. In seguito al trattamento con Etoposide (un inibitore delle topoisomerasi usato nella terapia delle LAM), si riscontrava una diminuzione significativa dell’espressione dei geni target di CREB coinvolti nel ciclo cellulare (CyA1, B1,D1), e nei geni cha fanno parte della via di segnale MAPK (ERK, AKT, DUSP1/4). Per verificare che l’attivazione di p38 fosse realmente indotta dall’abbassamento delle DUSPs, abbiamo silenziato DUSPs1/4 nella linea cellulare leucemica HL60, confermando lo stesso aumento di sensibilità al trattamento chemioterapico provocata dalla reintroduzione di ICER. Inoltre, il silenziamento delle DUSPs1/4 o l’espressione esogena di ICER nelle culture primarie di LAM, portavano all’abbassamento di DUSP1 e all’attivazione di p38. In questo lavoro abbiamo dimostrato che ICER aiuta l’attività chemioterapica attraverso l’attivazione della via di segnale DUSP-p38, riprogrammando quindi le cellule leucemiche dalla sopravvivenza all’apoptosi. Questi risultati suggeriscono che ICER ha un importante ruolo di regolatore di CREB. Ci siamo poi interessati a scoprire la causa della sovra espressione di CREB nelle LAM. Dato che CREB risulta sovra espresso in forma proteica, siamo andati a valutare la sua regolazione traslazionale, focalizzandoci sui microRNA. E’ stato dimostrato che uno di questi, il miR-34b, si lega alla la regione 3’UTR del gene CREB, ed è sotto espresso nelle LAM. Con studi in vitro su linee cellulari di LAM, abbiamo scoperto che la down regolazione del miR-34b era dovuta all’ipermetilazione del suo promotore. Quindi siamo andati a valutare la funzione del miR-34b come modulatore di CREB. analizzando la sua espressione e la metilazione del suo promotore nei pazienti affetti da patologie mieloidi. Nei pazienti pediatrici affetti da disordini ematopoietici preleucemici, come la JMML (juvenile myelomonocytic leucemia, n=17) e MDS (myelodysplastic sindrome, n=28) abbiamo trovato una normale espressione di miR-34b, unitamente ad una bassa espressione di CREB. Al contrario, nei pazienti alla diagnosi di LAM (n=112), il miR-34b è stato trovato sotto espresso. Nel 66% delle LAM, è stata riscontrata l’ipermetilazione del suo promotore, spiegando così la bassa espressione di miR-34b e la sovra espressione di CREB, mentre nei pazienti affetti da malattie preleucemiche come JMML e MDS, non è stata trovata la metilazione del promotore di miR-34b, e l’espressione di CREB è risultata infatti normale. Dall’analisi di alcuni pazienti affetti da MDS e successivamente evoluti in LAM, abbiamo confermato che l’ipermetilazione del promotore di miR-34b insorgeva al momento dell’evoluzione in LAM. Inoltre, tracciando un profilo di espressione genica dei suddetti pazienti, abbiamo scoperto che 103 geni target di CREB erano differenzialmente espressi tra le due fasi di malattia. In una coorte separata di pazienti (n=20) è stato confermato che lo stesso sottogruppo di geni target di CREB era associato ad MDS ad alto rischio di evoluzione in LAM, identificando così uno specifico profilo di trasformazione leucemica. Per verificare ulteriormente la nostra ipotesi, abbiamo valutato il miR-34b come potenziale oncosoppressore in vitro e in vivo, trovando che la sua espressione esogena portava alla diminuzione sia della progressione tumorale che dell’invasione dei tessuti, inibendo l’azione di CREB e l’espressione dei suoi geni target. Questi risultati hanno confermato che il miR-34b controlla l’espressione di CREB, e che la metilazione del suo promotore contribuisce alla trasformazione leucemica mieloide. Inoltre abbiamo identificato un sottogruppo di geni target di CREB che rappresenta un nuovo network trascrizionale coinvolto nella trasformazione tumorale, aprendo la strada a nuovi possibili studi funzionali su questi geni. Con queste premesse, abbiamo deciso di sviluppare un modello in vivo di zebrafish per valutare il ruolo di CREB e dei suoi geni target nell’insorgenza della leucemia. La scelta di questo organismo modello è stata dettata dai numerosi vantaggi che presenta, che negli ultimi anni lo hanno portato ad essere ampiamente usato sia in studi di sviluppo che nella ricerca sul cancro. Infatti, lo zebrafish possiede alta capacità rigenerativa, ha uno sviluppo embrionico rapido, allo stadio di embrione è trasparente, e ha numerose possibilità di manipolazioni genetiche. Nel presente studio, per sovra esprimere CREB nella linea mieloide di zebrafish, abbiamo iniettato un plasmide codificante CREB umano sotto il controllo del promotore pu.1 all’interno di uova fertilizzate allo stadio unicellulare, L’analisi dei geni che regolano l’ematopoiesi, ha dimostrato che negli embrioni a 24 e 48 ore di vita, la sovra espressione di CREB portava ad una perturbazione ematopoietica, e ad un’alterazione di espressione genica dei target di CREB, conferendo una progressione del ciclo cellulare. A partire dai 6 mesi dall’induzione dell’espressione di CREB, le popolazioni cellulari del midollo mostravano una lieve dismielopoiesi, caratterizzata prevalentemente da un’aumentata quota di mielociti e monociti.Tra i 9 e i 14 mesi dall’induzione esogena di CREB, i pesci manifestavano un’espansione addominale e dorsale, che ad una valutazione morfologica si è rivelata una massa addominale formata da cellule clonali con capacità infiltranti. E’ stato provato che le cellule della massa originavano dalle cellule che sovra esprimevano CREB umano, e possedevano alta capacità proliferativa. Queste cellule avevano infiltrato tessuti ed organi, quali branchie, tessuto adiposo e muscoli. Ad un esame morfologico, le cellule della massa apparivano del tutto simili alle cellule che popolavano il midollo dei pesci malati, con una completa perdita dei mielociti ed una preponderanza di monociti, confermando un disordine mieloproliferativo. Questi risultati mostrano che gli zebrafish sovra esprimenti CREB hanno manifestato la stessa dismielopoiesi già descritta in vitro e nei topi transgenici sovra esprimenti CREB, probabilmente mediata da un’elevata espressione dei geni target di CREB. La lunga latenza dell’insorgere della malattia suggerisce che potrebbero esserci ulteriori eventi che inducono la trasformazione tumorale. In conclusione, il modello di zebrafish creato in questo lavoro descrive una patologia mieloproliferativa indotta da CREB, e può rappresentare uno strumento utile per poter studiare il ruolo di CREB nella leucemogenesi. Inoltre, l’utilizzo di ICER e del miR-34b come oncosoppressori, e lo screening di nuovi composti che interferiscano con l’attività di CREB e con l’espressione dei suoi geni target, può aprire la strada a nuove opportunità terapeutiche.