"Molecular and functional studies of REEP1 (Receptor Enhancing Expression Protein) protein involved in Hereditary Spastic Paraplegias"

Mutations in the gene encoding REEP1 protein are responsible for SPG31, a common autosomal dominant Hereditary Spastic Paraplegia. The biological role of REEP1 and the pathogenetic mechanism underlying disease are unknown. This project aimed to explore the function of REEP1 and the mutant variants involved in HSP pathology using different experimental approaches in mammalian cell cultures. The studies carried out in our laboratory shown that REEP1 is involved in lipid droplets (LDs) biogenesis and its localization depends by the cell energetic balance; also it has the characteristic of forming oligomers to makes its function. We first demonstrated that REEP1 is localizes to ER membranes, with both the extremities C- and N- terminal face the cytoplasm; its trasmembrane domain appear too short to be inserted into the phospholipidic bilayer of ER membrane; but it is possible that the first transmembrane domain is inserted only in the external ER phospholipidic layer. This is supported by the evidence that REEP1 localization changes, going from ER to the LDs monolayer when the lipid metabolism was increased or the protein synthesis inhibited, . The relocation of REEP1 in LDs is supported by the theory that ER membranes are the site of LDs biogenesis: LDs grow between the ER phospholipidic bilayer and after they or break away or extrude from ER remain anchored to ER by a stalk. This hypothesis is supported by the presence of ER resident protein in LDs membranes: these proteins can shift from ER to LDs after a intra cellular signal, and vice versa. We then focused our attention to REEP1 pathological mutations. REEP1P19R, a missense mutation with an aminoacidic substitution in the first transmembrane domain. We demonstrated that REEP1P19R localizes on LDs membranes and relocates to the ER when fatty acids synthesis is inhibited. Moreover we shown that this pathological mutation prevents REEP1 oligomerization. REEP1A132V is a missense mutation that present the aminoacidic substitution in a site supposed to be important for microtubules binding. Indeed REEP1A132V localizes to ER membranes and partially overlaps the microtubules cythoskelethon. These results suggest a REEP1 function in LDs metabolism and open new perspectives to understand the of HSPs pathogenic mechanism and the process of neurodegeneration.

Mutazioni nella proteina REEP1, codificata dal gene SPG31, sono responsabili di una comune forma autosomica dominante di Paraplegia Spastica Ereditaria (HSP). La funzione biologica di REEP1 e i meccanismi patogenetici che si trovano dietro a questa malattia rimangono ad oggi sconosciuti. Questo progetto ha lo scopo di investigare la funzione di REEP1 e delle sue mutazioni attraverso differenti approci sperimentali che prevedono l’uso di colture cellulari di mammifero. Studi svolti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che REEP1 è coinvolto nella biogenesi dei lipid droplets (LDs) e che la sua localizzazione dipende dal bilancio energetico della cellula; inoltre questa proteina ha anche la caratteristica di formare oligomeri per poter svolgere la propria funzione. Inizialmente abbiamo dimostrato che REEP1 è localizzato sulla membrana del reticolo endoplasmatico (ER), con entrambe le sue estremità N- e C- terminali rivolte verso il citoplasma della cellula, mentre il dominio trans membrana della proteina sembra troppo corto per poter attraversare interamente il doppio strato fosfolipidico della membrana del ER; è però possibile che REEP1 sia inserita solo nello strato fosfolipidico esterno. Questa ipotesi è avvalorata dal fatto che quando il metabolismo lipidico viene incrementato o la sintesi proteica inibita, la localizzazione di REEP1 cambia, spostandosi dal reticolo ai LDs; inoltre il reticolo endoplasmatico è anche la sede di biogenesi dei LDs, in particolare sembra che i LDs crescano all’interno del doppio strato fosfolipidico del reticolo endoplasmatico per poi essere definitivamente separati dal reticolo oppure, e questa sembra l’ipotesi più probabile, estrusi dal reticolo, rimanendo però attaccati ad esso tramite una lunga lamella di membrana fosfolipidica detta ”stelo”. Ci sono infatti delle proteine di membrana che si trovano sia sul reticolo che sulla membrana dei LDs: queste proteine possono quindi spostarsi lungo la membrana passando dal reticolo ai LDs dopo l’attivazione di opportuni segnali intracellulari, e viceversa. Successivamente ci siamo focalizzati sulle mutazioni patologiche di REEP1: REEP1P19R è una mutazione missenso che presenta una sostituzione amminoacidica nel primo dominio transmembrana. Abbiamo dimostrato che REEP1P19R è localizzata sulla membrane dei LDs e viene spostata sulla membrane del reticolo endoplasmatico quando la sintesi degli acidi grassi viene inibita. Inoltre abbiamo evidenziato che questa mutazione patologica non è in grado di dimerizzare. REEP1A132V è una mutazione missenso che presenta una sostituzione amminoacidica in una posizione che si suppone essere importante in quanto sito di legame con i microtubuli. Inoltre REEP1A132V è localizzata sulla membrane del ER ma è anche parzialmente sovrapposta ai microtubuli. Questi risultati suggeriscono che REEP1 possa avere una funzione nel metabolismo dei LDs e aprono nuove prospettive per quanto riguarda il meccanismo patologico e i processi neurodegenerativi causati da HSP.