Welcome to the jungle: insights into the innate defence peptides

Understanding innate defence mechanisms is not only an exercise of pure science, but can give the scientific community new tools in fighting pathogens. In particular, the emergence of strains multi-resistant to common antibiotics gave a rush to the identifi-cation of new bioactive molecules. Possible candidates are a variety of endogenous gene-encoded antibiotics, evolved together with other humoral effectors to protect hosts from infective agents, beyond adaptive immunity. The main target of the thesis is to get further insights in the actual “jungle” of AMPs, in particular on their mechanism of action, with the final goal of improving their perfor-mance against so-called ESKAPE pathogens. Thus, I’ve developed new specific methods, starting from in silico predictions to high-throughput characterisation of mutants, and characterized new molecules, in particular peptides derived from bivalves, as lead com-pounds for anti-infective drugs. To achieve these goals, I worked with different labora-tories expert in peptide synthesis, structural bioinformatics or recombinant protein pro-duction. The first chapter gives an overview on antimicrobial peptides, with particular attention to CSαβ peptides. Such peptides display features useful for the development of new antibiotics, such as high stability and immunomodulatory properties. The second chapter presents the work done in collaboration with the Chemical sci-ences Department of the University of Padua on the structural characterization of CSαβ peptides. Considering the abundance of putative AMP sequences and the scarcity of ef-fectively produced and market-oriented peptides, we developed a cysteine-guided mo-lecular dynamics protocol for CSαβ structure refinement. This could support the research of active fragments before the recombinant production or chemical synthesis of the whole peptide. The proposed protocol is now published in the Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, issue of Sep 2016. As proof of application of chapter 2 protocol, the third chapter illustrates the exper-imental work on myticin C, a polymorphic AMP from M. galloprovincialis. Such molecule displays interesting immuno-related properties. Starting from a structural model, we were able to design MytC-derived active fragments showing properties similar to the whole peptide. Part of results presented in this thesis are now published in the Journal of Agricultural and Food Chemistry, issue of Oct. 2015. Aiming to increase the repertoire of available bioactive AMPs, we selected five putative antimicrobial peptide sequences from M. galloprovincialis transcriptomic data and, after preliminary trials in E. coli, the yeast Pichia pastoris was selected for a more advantageous recombinant production. This work, described in the fourth chapter, was done in collaboration with ETHZ (Swiss), namely in the laboratory of Prof. Markus Aebi, where I spent six months under the supervision of Doctor Andreas Essig. Actually two proteins have been produced, one of them showing an interesting range of antimicrobial activity. During my staying at ETHZ, I’ve worked on copsin, a defensin-like peptide previously identified in the fungus Coprinopsis cinerea and the fifth chapter describes the high throughput production of site-directed copsin mutants and the in silico characterization of membrane interaction of copsin and of one copsin mutant with improved features, named k-copsin. In the appendix are reported experimental inputs supporting other research lines carried on in the Dott. Paola Venier laboratory.

Capire come funziona l’immunità innata non significa solo sviluppare nuove cono-scenze di base, ma può fornire alla comunità scientifica nuovi strumenti per combattere organismi patogeni. In particolare, la comparsa di ceppi multi-resistenti ai comuni anti-biotici ha spinto la ricerca di nuove molecole bioattive. Tra i possibili candidati vi sono antibiotici endogeni codificati da geni ed evoluti insieme ad altre molecole effettrici per proteggere ospite da agenti infettivi indipendentemente dalla immunità di tipo adattativo. L’obiettivo principale della tesi è stato quello di cercare nuove evidenze riguardo questa giungla di AMPs, in particolare sul loro meccanismo d’azione, con l’obiettivo di migliorare la loro performance contro il gruppo di patogeni cosiddetti ESKAPE. Per fare ciò ho sviluppato nuovi metodi di indagine specifici, a partire dalla predizione in silico fino alla caratterizzazione di mutanti, e caratterizzato nuove molecole, in particolare derivate da bivalvi. Per raggiungere questi risultati ho collaborato con diversi laboratori esperti nella sintesi di peptidi, in bioinformatica strutturale e nella produzione ricombinante di proteine. I peptidi antimicrobici naturali sono strutturalmente diversi, ma presentano alcune caratteristiche comuni. Il primo capitolo offre una panoramica sui peptidi antimicrobici, con particolare attenzione ai cosiddetti peptidi CSαβ che posseggono alcune caratteristiche interessanti, come elevata stabilità e proprietà immunomodulatorie. Il secondo capitolo presenta il lavoro fatto in collaborazione con il Dipartimento di Scienze chimiche dell’Università di Padova e riguardante la caratterizzazione strutturale di peptidi CSαβ. Considerando l’abbondanza di sequenze di possibili peptidi antimicrobici e la scarsità di peptidi efficacemente prodotti e orientati al mercato, abbiamo sviluppato un protocollo bioinformatico basato sui ponti disolfuro ed in grado di migliorare predizioni di struttura. Questo potrebbe essere utile nella ricerca di frammenti attivi senza la necessità di produrre l’intero peptide. Il protocollo è stato pubblicato nel Settembre del 2016 in Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. Come prova dell’utilità di tale protocollo, il terzo capitolo riporta il lavoro speri-mentale effettuato sulla miticina C, un peptide antimicrobico polimorfico di M. gallopro-vincialis con interessanti proprietà legate all’immunità. Partendo da predizioni strutturali, siamo stati in grado di disegnare dei frammenti attivi derivanti dalla miticina C aventi proprietà simili a quelle del peptide intero. Parte di questo lavoro è già stato pubblicato nell’Ottobre del 2015 nel Journal of Agricultural and Food Chemistry. Con l’obiettivo di aumentare il repertorio di AMP bioattivi disponibili, abbiamo sele-zionate cinque sequenze di possibili peptidi antimicrobici dai dati trascrittomici di M. galloprovincialis puntando su Pichia pastoris, dopo i primi tentativi in E. coli, per una più vantaggiosa produzione ricombinante di tali peptidi. Questa parte di lavoro, descritta nel quarto capitolo, è stata svolta in collaborazione con l’ETH di Zurigo, in particolare nel laboratorio del Prof. Markus Aebi, sotto la supervisione del Dott. Andreas Essig. Per il momento siamo stati in grado di produrre due peptidi, uno dei quali ha un interessante spettro di attività antimicrobica. Durante il periodo all’ETHZ, ho lavorato sulla copsina, una defensina identificata nel fungo Coprinopsis cinerea. Nel quinto capitolo è descritta la produzione di mutanti della copsina e la caratterizzazione computazionale dell’interazione a livello di membrana di due versioni della copsina, la prima wild-tipe ed una seconda con caratteristiche migliorative. L’articolo relativo ai dati presentati sta per essere sottoposto a peer review. In appendice sono presentati i contributi sperimentali a supporto di altre linee di la-voro presenti nel laboratorio della Dott.ssa Paola Venier.